5-甲基胞嘧啶羟化酶TET1在肝再生时卵圆细胞向肝细胞分化过程中的作用

发布时间：2017-06-29 01:07

  本文关键词：5-甲基胞嘧啶羟化酶TET1在肝再生时卵圆细胞向肝细胞分化过程中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝脏作为人体一个重要代谢器官,当其受到不同病因的影响导致的肝细胞受损后,会发生不同类型干细胞介导的肝再生(liver regeneration)。肝干细胞主要分为内源性干细胞和外源性干细胞。其中内源性干细胞主要以卵圆细胞为主；外源性干细胞主要来源于造血干细胞,间充质干细胞,内皮祖干细胞等。卵圆细胞作为肝脏的成体干细胞在肝脏再生过程中发挥核心作用。肝卵圆细胞是存在于肝内胆管末端赫令管间隙的一类具有多向分化潜能的细胞群,其在正常情况下呈静止状态,当发生各种肝脏的损伤后便刺激其增殖分化,形成成熟的肝脏细胞和胆管上皮细胞,完成肝脏形态学和功能学上的修复。目前,关于卵圆细胞增殖分化的调控机制尚无定论。因此,探索其新的调控机制很有必要。 最新研究报道,表观遗传学的DNA去甲基化与干细胞的增殖分化密切相关。其中DNA羟化酶TET1(Ten-eleven translocation1)是催化5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)去甲基化生成5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroymethylcytosine,5hmC)的关键因子,其在胚胎干细胞分化过程中具有促进干性基因转录同时抑制分化基因表达的双重作用。即在胚胎干细胞的发育过程中呈下调趋势。但目前TET1调节干细胞自我更新和分化发育的具体机制还在研究之中,尚不明确。 因此,本课题分以下几个部分：1.卵圆细胞增殖肝再生动物模型的建立,即成功建立卵圆细胞增殖的动物模型。2.肝卵圆细胞的分离、提取、培养及鉴定。获得大鼠原代卵圆细胞并鉴定其特异性。3.检测TET1在肝再生动物模型中的动态变化。通过不同实验方法检测TET1在肝再生不同时间段的表达变化趋势。4.检测TET1在卵圆细胞株WB-F344向肝细胞样细胞分化过程中的表达变化。通过建立诱导卵圆细胞株WB-F344向肝细胞样细胞分化的培养体系,观察TET1在其基因和蛋白水平的表达变化。通过上述研究,旨在说明：1.TET1在肝再生过程中的明显的动态变化。2.TET1在卵圆细胞分化为肝细胞样细胞过程中明显下调,从而初步证明TET1可能参与了卵圆细胞的增殖与肝再生过程。 方法 1.肝再生动物模型建立取重约150-180g SD大鼠,2-AAF10mg/kg·d灌胃4d。第5天行2/3肝切除术,之后继续2-AAF灌胃。肝切除术后第3、6、9、12、15天处死大鼠获取肝脏标本。 2.原代大鼠卵圆细胞的提取及鉴定原位肝灌注联合离体肝灌注法分离大鼠肝脏细胞,再采用Percoll密度梯度离心法提取目的卵圆细胞。鉴定方法包括肝卵圆细胞形态学鉴定,细胞特异性标记物鉴定等。 3.检测TET1在肝再生动物模型中的动态表达变化包括RT-PCR检测TET1在mRNA水平的动态变化,Western blot检测TET1蛋白水平的表达趋势。 4.多种细胞因子联合诱导原代大鼠肝卵圆细胞卵圆细胞株WB-F344向肝细胞样细胞分化根据实验分为二组,原代不加任何细胞因子培养WB-F344为对照组,用SCF20ug/L、HGF10ug/L, EGF10ug/L等细胞因子诱导7天的WB-F344为实验组。 5.检测诱导前后WB-F344细胞表达卵圆细胞和肝细胞特异性蛋白通过细胞免疫荧光技术分别检测诱导前后卵圆细胞特异性抗体OV6,肝细胞特异性抗体ALB和AFP,胆管上皮细胞特异性抗体CK19的蛋白水平表达变化。 6.细胞免疫荧光、Realtime PCR、Western blot检测诱导前后TET1mRNA和蛋白水平表达变化。 结果 1.卵圆细胞增殖动物模型的成功建立。第3、6、9、12、15天取出大鼠剩余肝脏标本,可见随着时间的推移大鼠腹部切口逐渐愈合,余肝体积增大,直至15天恢复正常肝脏大小。 2.采用原位肝灌注加离体肝灌注法联合Percoll密度梯度离心法获得的肝卵圆细胞数量1.34×105/mL。提取的目的细胞倒置显微镜下可见呈圆球形,培养24h后呈半贴壁状态。特异性标记物OV6细胞免疫荧光染色阳性,细胞纯度≥80%。 3. RT-PCR、Western blot检测TET1在肝再生模型中的基因和蛋白表达水平。3d组和6d组的TET1基因表达水平较肝切前对照组明显升高(P0.01),与其蛋白水平表达趋势一致。9d组的表达量与肝切前表达无统计学差异性(P0.05)。而肝切后的后期(12、15d)TET1的表达下调(P0.05),与其蛋白水平动态变化趋势相同。 4.卵圆细胞株WB-F344经过SCF20ug/L、HGF10ug/L、EGF10ug/L等细胞因子诱导后,与诱导前相比较,细胞呈长梭形细胞或多角形改变,核质比减少,形态类似于培养状态下肝细胞。 5.卵圆细胞株WB-F344经过SCF20ug/L、HGF10ug/L、EGF lOug/L等细胞因子诱导后,与对照组卵圆细胞特异性抗体OV6染色阳性,ALB、AFP呈阴性表达相比,诱导后的细胞OV6表达阴性,且肝细胞特异性标记物ALB和AFP呈阳性表达。 6.卵圆细胞株WB-F344经过SCF20ug/L、HGF10ug/L、EGF10ug/L等细胞因子诱导后,TET1转录水平明显下调(P0.01),细胞免疫荧光、Western blot检测诱导前后TET1蛋白水平明显下降与基因水平表达一致。 结论 1.通过2-AAF联合2/3肝切除术成功建立卵圆细胞增殖的动物模型。 2.在肝再生模型中,通过原代细胞提取获得较高数量和纯度的肝卵圆细胞,证明卵圆细胞在此过程中大量增殖。 3.在肝再生动物模型中TET1的表达早期明显升高,直至肝切术后第6天到达峰值,之后TET1表达随着肝脏修复逐渐降低。本结果与卵圆细胞在肝再生过程中的增殖变化较一致,从而证实TET1与卵圆细胞增殖过程的密切相联。 4.体外诱导肝卵圆细胞分化成为肝细胞样细胞,即在卵圆细胞干性降低分化为肝细胞样细胞的过程中,TET1表达水平同时出现明显下调趋势,提示TET1与卵圆细胞的自我更新与分化密切相关,它可能通过参与了卵圆细胞的分化调控从而影响肝脏的再生修复过程。
【关键词】：肝脏再生 卵圆细胞 细胞分化 TET1
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R333.4
【目录】：

• ~.略语表5-6
• Abstract6-10
• 摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 卵圆细胞增殖的肝再生动物模型的建立15-20
• 2.1 引言15
• 2.2 材料与方法15-18
• 2.3 结果18-19
• 2.4 讨论19-20
• 第三章 肝卵圆细胞的分离、提取、培养及鉴定20-30
• 3.1 引言20
• 3.2 材料与方法20-27
• 3.3 结果27-28
• 3.4 讨论28-30
• 第四章 TET1在肝再生过程中的动态表达变化30-38
• 4.1 引言30
• 4.2 材料与方法30-36
• 4.3 结果36-37
• 4.4 讨论37-38
• 第五章 TET1在卵圆细胞株WB-F344向肝细胞样细胞分化过程中表达变化38-46
• 5.1 引言38
• 5.2 材料与方法38-41
• 5.3 结果41-43
• 5.4 讨论43-46
• 全文结论46-47
• 参考文献47-51
• 文献综述 TET蛋白家族调控干细胞的相关研究进展51-59
• 参考文献56-59
• 攻读硕士学位期间撰写论文情况59-60
• 致谢60

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本文编号：495958