普通棉耳狨猴腺病毒5型中和抗体水平测定

发布时间：2017-07-03 08:16

  本文关键词：普通棉耳狨猴腺病毒5型中和抗体水平测定

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【摘要】：腺病毒(Adeno virus)是一种从腺样体组织分离培养得到的双链DNA病毒,主要在细胞核内繁殖。它不仅是呼吸道、结膜和肠道感染的常见病原体,还能引起无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎和肝炎等疾病。腺病毒在自然界广泛流行,具有传染性强,宿主范围广的特点,尤其对于婴幼儿、老人、HIV感染者、移植手术患者等免疫功能低下的人群,腺病毒更是常见的感染因素之一。随着免疫学、病毒学、分子生物学等多学科的相互渗透和发展,腺病毒在分子水平上的应用越来越广泛,特别是有关腺病毒感染、抗腺病毒治疗和腺病毒载体应用己成为研究的热点。病毒载体疫苗是指以病毒作为载体,将保护性抗原基因重组到病毒基因组中,使用能表达保护性抗原基因的重组病毒制成的疫苗。这种疫苗多为活疫苗,且用量少,抗原的免疫原性接近天然,抗原也不需要纯化,接种后靠重组体在机体内大量表达保护性抗原刺激机体产生特异性免疫保护反应,载体本身亦可发挥佐剂效应来增强免疫效果。多种病毒载体如腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、逆转录病毒、微小RNA病毒、杆状病毒等,都己用于疫苗研究,其中腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、甲病毒载体等病毒载体疫苗己进入人体临床试验阶段。在这些病毒载体中,人腺病毒载体具有以下优点：①可装载外源基因容量大；②安全性好；③规模化生产工艺成熟,制剂稳定性好,并可在悬浮培养中获得较高的滴度；④宿主范围广,可感染静止和分裂的细胞；⑤腺病毒血清型丰富,疫苗载体选择广；⑥腺病毒载体能感染呼吸道和肠道细胞,可以方便地通过黏膜进行免疫,并能诱导机体产生黏膜和系统免疫应答；⑦免疫原性强,能产生很强的体液与细胞免疫；⑧转导效率高,这些优点使腺病毒作为载体的基因治疗和疫苗研究迅速发展。目前,应用最多的腺病毒载体是人血清腺病毒5型(Human Mastadenovirus 5, AdHu5),主要原因是它的免疫原性比其他腺病毒亚型更强。以重组复制缺陷型人腺病毒5型(rAd5)为载体的疫苗,能诱导机体产生强烈的针对目的抗原的免疫应答,因此被广泛应用于人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒、疟疾、结核等多种病原体的疫苗研制。然而,近20年来科学家们研究的重点在于探究限制AdHu5的临床使用的原因： (1)往人体内静脉注射AdHu5载体时高强度的天然免疫毒性；(2)与剂量依赖相关的肝毒性；(3)全世界人体内存在针对AdHu5的高预存适应性免疫,即人体内存在高滴度的预存中和抗体。由rAD5载体介导的HIV疫苗的临床试验失败表明,人体内较高滴度的Ad5中和抗体水平会显著降低载体转导效率和外源基因表达水平,并且可能引发机体产生不良反应。但AdHu5载体疫苗可以在与人基因同源性高达99.9%的非人灵长类动物模型上,对疫苗所要引起保护性免疫的目的基因进行免疫原性和耐受性等的评价。因此,首先需要在这种非人灵长类动物上进行AdHu5中和抗体水平检测。近年来,一种广泛应用于基础生物学、药理学和毒理学研究的新世界灵长类动物——普通棉耳狨猴(common marmoset,学名Callithrix jacchus)已走入科学界。普通棉耳狨猴是一种原产于巴西东北部大西洋沿海森林的新世界非人灵长类动物,属绒科(Callitrichidae)。与其他灵长类动物相比,普通棉耳狨猴的寿命较短,一般在18～24个月成年,雌性狨猴3岁后可繁殖后代,8岁就步入老年期。由于压缩的寿命及良好的繁殖效率,科学家认为狨猴可满足快速扩充实验动物数量及限制实验动物增殖的需求。成年普通棉耳狨猴重约350～400克,体型小巧,性情温顺,对环境的破坏能力极小,因此适用于人工饲养繁殖及实验需求,这一优势带来的巨大效应不仅减少了喂养成本和空间需求,更增加了实验材料的利用效率。多种实验证明,普通棉耳狨猴是一个优秀的研究老化、生殖、神经学、毒理学和传染病的模型。狨猴模型的大幅度使用对加速疫苗的临床前开发过程及高致病性病毒的治疗起了巨大的推动作用。但有学者研究巴西与美国新世界猴体内腺病毒水平,发现有来自巴西的普通棉耳狨猴中人腺病毒5型中和抗体阳性率为31.3%,而美国的普通棉耳狨猴暂未发现阳性,可能与饲养环境及接触生物有关。而我国引进饲养和繁殖的普通棉耳狨猴的人腺病毒5型中和抗体水平未见报道。本实验室课题组前期构建了HCV/GBV-B嵌合病毒感染狨猴模型,预以该狨猴模型进行腺病毒载体丙型肝炎病毒候选疫苗的临床前评价,首先需以人腺病毒5型作为载体,在狨猴模型上对所要研究的病毒基因进行免疫原性和耐受性等的评价,因此在使用载体前检测其体内人5型腺病毒的中和抗体水平就显得极为重要。目的：本研究旨在测定普通棉耳狨猴血清中的腺病毒5型中和抗体水平,评价采用化学发光法或流式细胞术分别测定荧光素酶或绿色荧光蛋白表达抑制情况的中和检测方法,评估普通棉耳狨猴作为重组腺病毒5型疫苗临床前研究的动物模型的可行性与适用性,为临床前试验用HCV疫苗候选株与产品的研发、最终实现HCV疫苗研制成功并在我国产业化提供重要背景信息。方法：目前对人或动物血清中和抗体的检测方法有两种,一种是野生型腺病毒被抗体中和后,观察感染细胞产生的细胞病变效应(CPE)；另一种则是复制缺陷腺病毒与血清中抗体反应后,读取其介导的转基因表达抑制情况,较常使用的报告基因包括荧光素酶(Luciferase)、绿色荧光蛋白(Zs Green)、半乳糖苷酶基因(LacZ)等。由于CPE的观察较主观,细胞培养时间较长,不适宜快速检测大样本血清,因此本实验选取后一种检测方法,即构建同时表达Luciferase与ZsGreen报告基因的重组复制缺陷型5型腺病毒,来检测普通棉耳狨猴血清中的腺病毒5型中和抗体水平。首先通过PCR技术从质粒pHAGE-CMV-Luc-IZs Green中扩增Luc-IZs Green目的基因,同时通过引物设计分别在目的基因5'、3'端引入EcoRI与NheI酶切位点。将目的序列插入腺病毒表达质粒pDC315中,构建成重组腺病毒穿梭质粒pDC315-Luc-IZs Green。接着利用脂质体转染的方法将构建好的腺病毒穿梭质粒与骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre按一定比例转染能提供反式作用E1蛋白的人胚肾293A包装细胞,从而包装成具有一定感染活性的携带Luciferase与Zs Green报告基因的重组腺病毒rAd5/LUC/Zs Green。对包装好的rAd5/LUC/Zs Green进行3次空斑形成实验,筛选单克隆重组腺病毒,并将低滴度单克隆病毒原液于293A细胞中进行大量扩增。rAd5/LUC/Zs Green大量扩增后采用氯化铯密度梯度离心法对其进行浓缩纯化,并通过50%组织培养感染剂量法(TCID50)测得纯化后重组腺病毒的感染滴度。通过分子克隆技术鉴定纯化后重组腺病毒仍携带Luciferase与Zs Green报告基因,即分别采用PCR或RT-PCR扩增纯化后rAd5/LUC/Zs Green的基因组DNA或细胞内总RNA中的Luc-IZs Green基因片段。同时使用细胞免疫组化实验验证重组腺病毒蛋白在293A细胞中是否有表达。再将纯化后rAd5/LUC/Zs Green进行倍比稀释感染293A细胞,检测荧光素酶与绿色荧光蛋白报告基因的表达效率,确定腺病毒中和实验的最佳病毒感染滴度。最后将25只普通棉耳狨猴的血清进行倍比梯度稀释,与最佳感染滴度的重组腺病毒混合后感染293A细胞,24小时后分别采用化学发光法与流式细胞术相应检测Luciferase与Zs Green报告基因。通过两种报告基因的读数判定狨猴有无中和抗体及其抗体滴度。结果：(1)重组穿梭质粒构建用分子克隆常规的方法成功构建与正确鉴定含有两种报告基因的腺病毒穿梭载体pDC315-Luc-IZs Green,并通过瞬时转染293A细胞的方法初步鉴定能正确表达标签蛋白。(2)重组腺病毒包装与滴度测定通过共转染构建好的腺病毒穿梭质粒和ADMax包装系统的骨架质粒至293A细胞,成功包装rAd5/LUC/Zs Green。经过3次空斑形成实验、大量扩增单克隆重组腺病毒并对其进行浓缩纯化后,采用TCID50方法测得腺病毒滴度为6.9×1011.5PFU/ml。(3)重组腺病毒鉴定通过PCR与RT-PCR扩增出基因组DNA与转录总RNA的Luc-IZs Green基因片段,鉴定纯化后的重组腺病毒携带目的基因,并通过细胞免疫组化验证病毒衣壳蛋白可以在293A细胞中表达。将rAd5/LUC/Zs Green进行倍比稀释感染293A细胞,检测荧光素酶与绿色荧光蛋白报告基因的表达效率,显示6.9×106.5PFU/ml～6.9× 107.5PFU/ml是适宜的中和实验腺病毒感染滴度。(4)普通棉耳狨猴中和抗体水平检测流式细胞术检测绿色荧光细胞百分率结果显示,共有5只(20%)普通棉耳狨猴血清人腺病毒5型中和抗体阳性,其中有4只的中和抗体滴度为1/16,另1只滴度为1/64。而通过化学发光法检测相对荧光素酶活性单位的结果显示,25只普通棉耳狨猴中共有7只(28%)可检测到中和抗体,其中有4只的中和抗体滴度为1/16,2只滴度为1/32,1只滴度为1/128。(5)两种检测方法对比统计分析显示,化学发光法与流式细胞术检测结果在统计学上具有一致性(P0.01),但略有差异。通过详细比较可知以Luciferase报告基因为主的化学发光法是更简便、灵敏、准确、稳定的实验方法。结论：(1)采用新型ADMax腺病毒包装系统,包装出同时携带荧光素酶与绿色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒rAd5/LUC/Zs Green.(2)检测了我国25只普通棉耳狨猴中预存腺病毒5型抗体水平。普通棉耳狨猴的抗Ad5血清流行率约为20%-30%,但抗体水平均低,多数滴度是1/16,少数在1/32,极少出现中高滴度。(3)比较以Luciferase或Zs Green报告基因表达的抑制情况计算得出中和抗体水平的两种不同检测方法,证实化学发光法是重复性高、灵敏度高、稳定性强,适宜多物种大样本实验设计的检测方法。(4)研究结果为普通棉耳狨猴成为评价人腺病毒5型或其他稀有腺病毒亚型载体候选疫苗的动物模型提供基础数据。
【关键词】：普通棉耳狨猴 腺病毒5型 中和抗体 荧光素酶 绿色荧光蛋白
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 1 前言17-34
• 1.1 腺病毒生物学特征18-21
• 1.2 腺病毒感染性21-23
• 1.3 腺病毒载体疫苗的研究进展23-25
• 1.4 重组人腺病毒5型疫苗载体应用25-29
• 1.5 普通棉耳狨猴特征、用途及腺病毒流行情况29-33
• 1.6 立题意义33-34
• 2 材料34-40
• 2.1 材料34-36
• 2.2 菌株、质粒和细胞株36
• 2.3 主要仪器与耗材36-38
• 2.4 主要溶液配置38-40
• 3 方法40-57
• 3.1 携带LUC-ZS Green报告基因重组穿梭载体的构建40-45
• 3.2 重组穿梭质粒的瞬时转染与鉴定45-47
• 3.3 重组腺病毒的构建、筛选、扩增、纯化与滴度测定47-51
• 3.4 重组腺病毒的鉴定51-55
• 3.5 检测普通棉耳狨猴血清腺病毒5型中和抗体方法55-56
• 3.6 统计学分析56-57
• 4 结果57-70
• 4.1 成功构建pDC315-LUC-IZs-Green穿梭质粒57-58
• 4.2 穿梭载体的瞬时转染58-59
• 4.3 成功构建重组腺病毒59-61
• 4.4 重组腺病毒的鉴定61-65
• 4.5 测定普通棉耳狨猴体内Ad5中和抗体水平65-69
• 4.6 统计学分析69-70
• 5 讨论70-73
• 总结73-74
• 参考文献74-82
• 缩略词表82-83
• 攻读学位期间成果83-84
• 致谢84-86

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