TLR2在HMGB1诱导的小鼠系膜细胞增殖中的作用及其可能机制

发布时间：2017-07-03 15:12

  本文关键词：TLR2在HMGB1诱导的小鼠系膜细胞增殖中的作用及其可能机制

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【摘要】：目的：本实验以小鼠系膜细胞为研究对象，以重组鼠HMGB1为刺激物，试图通过检测其受体Toll样受体2(TLR2)的诱导表达情况及沉默其受体后，细胞增殖及细胞周期相关蛋白的表达变化，初步探讨HMGB1通过其受体对系膜细胞的促增殖作用。 系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，其特征是多器官受累，产生抗核抗体及免疫复合物的沉积[1]。狼疮性肾炎（Lupus nephritis，LN）被视为SLE最严重之一的器官表现，影响约35％至50％的狼疮患者。尽管对其发病机制有了深入的了解，其临床治疗效果越来越好，但狼疮性肾炎仍是SLE患者死亡的主要原因。 高迁移率族蛋白-1（High mobility group protein-1,HMGB1）是一个被发现在所有哺乳动物细胞的核内蛋白，被称为DNA结合蛋白，参与染色质结构和基因转录的调控[2]。而细胞外HMGB1已被确定为一种炎症介质，由于其促炎性和免疫刺激特性，参与多种慢性炎症和自身免疫性疾病的发病[3]。HMGB1不但由活化的免疫细胞主动分泌（如巨噬细胞和单核细胞），而且也被动地从损伤或坏死细胞中释放[4]。此外，HMGB1诱导产生其它细胞因子如肿瘤坏死因子和白细胞介素-1（IL-1）、IL-6和IL-8，并且它还是一种内皮细胞的激活剂，导致粘附分子的上调。研究发现，在不同的炎症性疾病中如败血症、类风湿性关节炎、抗中性粒细胞胞质-MATIC抗体（ANCA）相关性血管炎、慢性肾脏疾病以及SLE[5]均伴有血清中HMGB1表达升高。另外，与活动性狼疮（非肾脏损害）的患者相比，在活动性狼疮性肾病患者血清中HMGB1水平明显增高[6]。我们前期的实验中检测了HMGB1及其可能受体TLR2、4在狼疮性肾炎患者外周血及狼疮小鼠肾组织中的表达情况，结果显示，HMGB1及TLR2、4在狼疮性肾炎发病过程中明显高表达，同时与系膜细胞的增生密切相关，推断HMGB1可能通过与其受体结合参与了狼疮时系膜细胞的异常增殖，促进了增生性肾小球肾炎的发生，但其确切机制，目前尚不清楚。 方法：选取小鼠系膜细胞MMC为研究对象，1）为了确定HMGB1对小鼠系膜细胞增殖的影响，将小鼠系膜细胞随机分为正常对照组及50μg/LHMGB1刺激组、100μg/L HMGB1刺激组和200μg/LHMGB1刺激组，分别培养2、4、8和12h，收集不同时间点不同浓度刺激的细胞，以BrdU掺入法检测小鼠系膜细胞的增殖水平。2）为了检测HMGB1对小鼠系膜细胞TLR2、PCNA、Cyclin D1、CDK4、p16表达的影响，将常规培养的MMC细胞随机分为正常对照组及100μg/LHMGB1刺激组，分别于培养2、4、6、8和12h时收集细胞，采用Real-time PCR及Western Blot检测小鼠系膜细胞TLR2、 PCNA、CyclinD1、CDK4、p16的表达变化。3）为了明确TLR2表达与HMGB1介导的MMC增殖中的作用，将MMC细胞随机分为正常对照组、HMGB1刺激组（100μg/L）、HMGB1刺激+pYr-3.1-shTLR2组（转染组）、HMGB1刺激+空白质粒组（空白质粒组），，刺激8h时收集细胞，Western Blot检测pYr-3.1-shTLR2的沉默效果及细胞周期蛋白PCNA、CyclinD1、CDK4、p16蛋白的表达变化。 结果： 1HMGB1上调小鼠系膜细胞增殖水平 以HMGB1刺激小鼠系膜细胞，在刺激2h，小鼠系膜细胞的增殖水平开始逐渐上升，至HMGB1作用8h，小鼠系膜细胞的增殖水平最高，至作用12h后其增殖水平稍有降低，但与8h相比，差异无统计学意义。BrdU结果显示，100μg/L及200μg/L浓度刺激下的增殖水平明显高于50μg/L浓度时，但200μg/L与100μg/L相比差异无统计学意义(P0.05)。 2HMGB1时间依赖性上调小鼠系膜细胞TLR2的表达 Real-time PCR结果显示，HMGB1明显上调TLR2mRNA表达，至HMGB1作用6h，TLR2的mRNA表达升高最明显(2.2±0.16)，与正常对照组相比，差异具有统计学意义（P0.05），至作用12h后其表达水平逐渐回落，但仍高于正常组。 Western Blot结果显示：HMGB1时间依赖性上调TLR2蛋白表达，至HMGB1作用8h蛋白表达达高峰(0.55±0.02)，12h时略有下降，但仍高于正常对照组（0.1±0.01），差异具有统计学意义（P0.05）。 3HMGB1刺激能够上调小鼠系膜细胞中PCNA mRNA及蛋白的表达 HMGB1能够诱导PCNA mRNA和蛋白表达升高，呈时间依赖性。mRAN表达在刺激6h达高峰(1.9±0.13)，而PCNA蛋白在8h时达高峰（0.56±0.02），12h逐渐回落，与正常对照组相比（0.28±0.01），差异均有统计学意义（P0.05）。 4HMGB1刺激能够上调小鼠系膜细胞中CyclinD1、CDK4mRNA及蛋白的表达 HMGB1上调CyclinD1、CDK4mRNA表达，至HMGB1刺激6h时表达水平最高(1.8±0.14、1.6±0.12)，与正常对照组相比，差异具有统计学意义（P0.05），而至HMGB1作用12h后其表达水平逐渐回落。 Western Blot结果显示：HMGB1上调CyclinD1、CDK4蛋白表达，至HMGB1作用8h蛋白表达达峰（0.43±0.02、0.23±0.01），与正常对照组相比（0.14±0.01、0.04±0.01），差异具有统计学意义（P0.05），至作用12h后逐渐回落，但仍高于正常对照组。 5HMGB1刺激后能够时间依赖性地降低小鼠系膜细胞中p16的表达 与正常对照组相比，至HMGB1作用2、4、6、8及12h时小鼠系膜细胞中p16mRNA及蛋白的表达水平呈持续降低趋势，呈时间依赖性，差异均有统计学意义（P0.05）。 6RNA干扰沉默TLR2表达，能够有效地下调HMGB1诱导的小鼠系膜细胞中细胞周期蛋白的表达，降低系膜细胞的增殖水平 与HMGB1刺激组相比（0.55±0.02、0.28±0.01、0.27±0.01、0.06±0.01），pYr-3.1-shTLR2转染组的小鼠系膜细胞的PCNA、CyclinD1、CDK4表达下降(0.28±0.01、0.10±0.01、0.10±0.01)，p16表达上调（0.14±0.01），差异具有统计学意义（P0.05）。 结论：HMGB1诱导了小鼠系膜细胞TLR2的表达，伴有细胞增殖水平升高和PCNA、Cyclin D1、CDK4表达上调，考虑HMGB1可能通过与小鼠系膜细胞膜表面受体TLR2结合后，通过某种信号途径上调细胞周期调控蛋白CyclinD1、CDK4的表达，并下调细胞周期依赖性激酶抑制剂p16的表达，推动细胞从G0/G1期进入S期，细胞增殖水平提高。但这只是细胞水平的初步研究，关于TLR2在HMGB1介导的系膜细胞增殖中的确切作用，尚需要动物实验进一步证实。
【关键词】：狼疮性肾炎 高迁移率族蛋白1 Toll样受体2 CyclinD1 CDK4 p16 PCNA 细胞增殖
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 目录3-4
• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-14
• 材料与方法14-23
• 结果23-26
• 附图26-32
• 附表32-35
• 讨论35-38
• 结论38
• 参考文献38-42
• 综述 HMGB1—一个风湿性疾病的危险信号42-55
• 参考文献50-55
• 致谢55-56
• 个人简历56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 张健;帅朝霞;胡志刚;王春新;袁劲松;陈国千;;JAK/STAT通路在脂多糖诱导肝细胞HMGB1释放中的作用[J];南京医科大学学报(自然科学版);2009年11期

2 封晓娟;刘淑霞;吕欣;徐宁;;HMGB1对小鼠系膜细胞细胞周期及细胞周期相关蛋白表达的影响[J];中国细胞生物学学报;2011年11期

3 刘淑霞;郝军;郭惠芳;陈宁;刘青娟;唐丽娟;吴海江;段惠军;;HMGB1/TLR/NF-κB在狼疮性肾炎小鼠肾组织中的表达及意义[J];中国免疫学杂志;2009年05期

4 唐丽娟;郝军;陈宁;郭惠芳;刘青娟;刘淑霞;;TLR/STAT通路在HMGB1诱导的系膜细胞增殖中的作用[J];中国免疫学杂志;2009年07期

5 封晓娟;刘淑霞;张玉军;郭惠芳;郝军;陈宁;唐丽娟;刘青娟;吴海江;;NF-κB信号途径在小鼠狼疮性肾炎发病中的可能作用[J];中国免疫学杂志;2010年02期

  本文关键词：TLR2在HMGB1诱导的小鼠系膜细胞增殖中的作用及其可能机制

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本文编号：514136