NOX2介导杨梅苷抑制LPS诱导的炎症反应

发布时间：2017-09-06 23:34

  本文关键词：NOX2介导杨梅苷抑制LPS诱导的炎症反应

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【摘要】：目的:以小鼠腹腔巨噬细胞白血病细胞系RAW264.7细胞为实验对象,在LPS诱导下,体外实验观察杨梅苷对NOX2来源的ROS活化介导JAKs/STAT1信号通路所致炎症反应的影响;同时,体内实验观察杨梅苷在LPS诱导小鼠急性肺损伤中的作用,从而探讨杨梅苷在LPS诱导的炎症反应中发挥抗炎作用的分子机制。方法:运用CCK-8法检测杨梅苷对RAW264.7细胞是否有毒性。在杨梅苷安全剂量范围内,运用Western blotting和RT-PCR检测杨梅苷对LPS诱导下i NOS和COX-2表达水平的影响,并确定杨梅苷的有效抗炎剂量范围。ELISA法检测杨梅苷在LPS诱导下促炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1、NO和PGE2含量变化的影响。Western blotting检测LPS诱导下MAPKs和JAKs/STATs信号通路活化时间以及杨梅苷对其活化的影响。激光共聚焦显微镜及EMSA实验观察杨梅苷对LPS诱导下STAT1蛋白的核转位以及其转录活性的影响。运用JAK抑制剂Ruxolitinib证实JAK-STAT信号通路与炎症介质以及促炎症因子之间的关系。运用活性氧探针检测杨梅苷对LPS诱导ROS产生的影响,并运用ROS抑制剂NAC证实ROS同JAK-STAT信号介导的炎症反应之间的关系。Western blotting与激光共聚焦显微镜分别观察杨梅苷对LPS诱导下NOX2膜亚基gp91~(phox)和胞质亚基p47~(phox)在胞质和质膜的分布情况变化。运用NOX抑制剂Apocynin证实NOX来源的ROS在JAK-STAT信号介导的炎症反应中的调控作用,并分别构建针对NOX2亚基gp91~(phox)和p47~(phox)表达的sh RNA干扰质粒载体,采用脂质体转染RAW264.7细胞,并验证其干扰效果,证实干扰gp91~(phox)和p47~(phox)表达后,对LPS诱导下ROS,p-JAK1,p-JAK2,p-STAT1,i NOS和COX-2的影响。构建LPS诱导的小鼠急性炎症性肺损伤模型,使用HE染色法观察杨梅苷对小鼠急性肺组织损伤的影响。结果:杨梅苷仅在500μg/ml时对RAW264.7细胞活力产生抑制作用,并在安全剂量范围内抑制LPS诱导的i NOS的蛋白及m RNA的表达,与此同时,杨梅苷对LPS诱导的COX-2表达无影响,并且我们选择100、200、400μg/ml杨梅苷作为抑制炎症作用的低、中、高剂量组。杨梅苷抑制LPS诱导相关促炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1、NO和PGE2的释放与产生。LPS刺激RAW264.7细胞pERK,p-JNK,p-P38的最大活化点为30 min左右,p-JAK1及p-JAK2的最大活化点在10 min左右,而p-STAT1,p-STAT3的最高活化点在4 h左右。杨梅苷下调LPS诱导的p-JAK1,p-JAK2及p-STAT1的活化而对MAPKs及p-STAT3无影响,并且杨梅苷可以抑制LPS诱导转录因子STAT1转位入核及其转录活性。杨梅苷抑制LPS诱导胞内ROS的产生,并可以阻断LPS诱导下p47~(phox)亚基向质膜的募集,使其与gp91~(phox)亚基发生聚合受阻,从而阻断ROS的来源。与此同时,LPS对p47~(phox)亚基和gp91~(phox)亚基的表达并无影响。杨梅苷的抗炎作用是通过调控NOX2来源的ROS介导的JAKs/STAT1信号通路活化产生的。干扰NOX2的gp91~(phox)和p47~(phox)的表达可以有效阻断LPS诱导下ROS累积,JAK1,JAK2,STAT1的活化及i NOS,COX-2的产生。结论:1)杨梅苷在无细胞毒性剂量范围内抑制LPS诱导的细胞炎症反应及改善小鼠急性肺损伤。2)杨梅苷抑制LPS诱导的RAW264.7细胞促炎症因子和炎症介质i NOS,NO,IL-6,TNF-α以及MCP-1的释放,而对COX-2及PGE2的释放无影响。3)杨梅苷抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应是通过阻断JAKs/STAT1信号转导通路来介导的,而对LPS诱导的MAPKs信号的活化无影响。4)NOX2来源的ROS是杨梅苷抑制LPS诱导的JAKs/STAT1依赖性炎症的作用靶点。5)杨梅苷通过阻断NOX2亚基p47~(phox)和gp91~(phox)的聚合从而下调ROS的产生。
【关键词】：杨梅苷 脂多糖 RAW264.7细胞 JAK-STAT信号转导通路 活性氧 NOX2
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R364.5
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-17
• 材料与方法17-31
• 结果31-62
• 1 杨梅苷对LPS诱导的RAW264.7 细胞炎症反应的影响31-44
• 1.1 杨梅苷对RAW264.7 细胞活力的影响31
• 1.2 杨梅苷对LPS诱导的iNOS和COX-2 蛋白水平及其mRNA水平的影响31-33
• 1.3 杨梅苷对LPS诱导的RAW264.7 细胞中促炎症因子释放的影响33-35
• 1.4 LPS对RAW264.7 细胞MAPKs及JAKs/STAT1信号活化的影响35-37
• 1.5 杨梅苷对LPS诱导的JAK2/STAT1信号和MAPKs的影响37-39
• 1.6 杨梅苷对LPS诱导的转录因子STAT1核转位和转录活性的影响39-42
• 1.7 阻断JAK-STAT信号通路对促炎症因子表达的影响42-44
• 2 杨梅苷对胞内NOX2来源的ROS调控下游的炎症信号的影响44-60
• 2.1 杨梅苷对LPS诱导的RAW264.7 细胞内源性ROS的蓄积的影响44-45
• 2.2 阻断ROS对JAK-STAT级联信号介导炎症因子的表达的影响45-46
• 2.3 LPS对p47~(phox)和gp91~(phox)的表达的影响46-48
• 2.4 杨梅苷对p47~(phox)从胞质向胞膜募集的影响48-50
• 2.5 阻断NOX家族对JAKs/STAT1信号介导的炎症因子的表达的影响50-54
• 2.6 沉默p47~(phox)和gp91~(phox)对LPS诱导的ROS-JAKs/STAT1-iNOS级联炎症反应的影响54-60
• 3 杨梅苷对Balb/c小鼠气管暴露LPS诱导的炎症性肺损伤的影响60-62
• 讨论62-68
• 结论68-69
• 下一步研究计划69-70
• 参考文献70-76
• 综述76-93
• 参考文献86-93
• 作者简介及读研期间主要科研成果93-94
• 致谢94

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本文编号：806107