日本血吸虫钙蛋白酶基因的原核表达及功能分析
发布时间：2017-09-09 04:10
本文关键词：日本血吸虫钙蛋白酶基因的原核表达及功能分析
【摘要】：目的克隆表达日本血吸虫钙蛋白酶(Sjcalpain),了解Sjcalpain在尾蚴内的分布及其在尾蚴侵染中的作用。方法根据SjCalpain基因全序列(GenBank登录号为AB016726)设计引物,PCR分别扩增Sjcalpain的催化位点区域和Ca2+结合位点区域的基因片段,克隆入pET-28a原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中进行原核表达,组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达和纯化情况。纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔多克隆抗体,ELISA和蛋白质印迹(Western blotting)分别检测多克隆抗体的效价和特异性。利用免疫荧光定位技术观察Sjcalpain在尾蚴组织中的分布情况。将尾蚴和钙蛋白酶抑制剂孵育后感染小鼠,计算血吸虫减虫率。结果成功构建了Sjcalpain的催化位点/pET-28a和Ca2+结合位点/pET-28a原核表达重组质粒,在E.coli BL21(DE3)中成功表达目的蛋白,相对分子质量(Mr)约为43 000和39 000,与预期大小一致,且均为包涵体表达。组氨酸标签亲和层析成功纯化得到目的重组蛋白。间接ELISA结果显示,多克隆抗体的效价超过1∶80 000。免疫定位结果显示,Sjcalpain在日本血吸虫尾蚴头部分布较多。尾蚴侵染抑制实验中,钙蛋白酶抑制剂作用组平均获虫19条,对照组平均获虫23条,减虫率为17.4%。结论 Sjcalpain蛋白产物主要分布在日本血吸虫尾蚴的头部;Sjcalpain被抑制后可以减少入侵宿主的尾蚴数量,说明Sjcalpain在尾蚴感染宿主皮肤过程中发挥一定的作用。
【作者单位】： 复旦大学生命科学学院微生物与微生物工程系;中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室 世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心;
【关键词】： 日本血吸虫 尾蚴 钙蛋白酶 免疫定位 侵染
【基金】：国家自然科学基金(No.81271867) 上海市自然科学基金(No.13ZR1462800)~~
【分类号】：R383.24
【正文快照】： 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)以尾蚴的形式入侵终宿主,完成整个生命周期。尾蚴分泌的蛋白酶在侵染过程中发挥主要作用,因此研究尾蚴分泌的蛋白酶的作用成为研究血吸虫侵染分子机制的热点[1-7]。钙蛋白酶(calpain)是一种分布较广的蛋白,常见于多种生物组织中,并发挥重要
【参考文献】
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1 黄成玉;卢艳;王玮;鞠川;冯正;杨忠;王升跃;胡薇;;日本血吸虫弹性蛋白酶基因的克隆、表达及虫期特异性转录[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2007年05期
2 汪世平;陈秀春;高冬梅;;我国血吸虫疫苗研究进展及应用前景[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2009年05期
3 刘建;徐斌;张晓;刘璐;胡薇;王小宁;;日本血吸虫硫氧还蛋白-1的克隆、表达和功能分析[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2012年05期
4 黄江;李波;戴佳琳;张爱华;;猪带绦虫CDC37基因的克隆、表达与组织定位研究[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2013年01期
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本文编号：818206
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