双靶向调控CDX2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

发布时间：2017-09-16 20:41

  本文关键词：双靶向调控CDX2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

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【摘要】：目的构建5个拷贝的HRE和hTERTp双靶向调控表达CDX2基因的慢病毒表达载体,并在结肠癌LoVo细胞中检测其启动活性。方法设计引物应用PCR法从人结肠癌基因组中克隆获得hTERT启动子,用双酶切和PCR法切除笔者所在课题组已构建的载体pLEGFP-5HRE-CEAp中的CEA启动子后,将hTERT启动子与该载体重组,构建出pLEGFP-5HRE-hTERTp;提取5HRE-hTERTp基因序列,同时双酶切切除pLVX-EGFP-3FLAG载体中的CMV启动子,同源重组构建获得pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体。设计引物应用PCR法从笔者所在课题组已构建的GV230-CDX2-EGFP载体中克隆获得CDX2基因序列,用双酶切和PCR法切除载体pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG中的EGFP后,将CDX2基因序列与该载体重组,构建出pLVX-5HREhTERTp-CDX2-3FLAG。应用pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,通过观察绿色荧光蛋白EGFP的表达,鉴定hTERTp的启动活性。结果经PCR和测序分析,pLEGFP-5HREhTERTp、pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG和pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG 3组质粒与设计一致,测序正确。将pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,有绿色荧光表达,提示hTERT启动子能够有效启动下游基因的表达。结论成功构建了pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG及pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG载体,为后续的体外和体内研究打下了基础。
【作者单位】： 西安交通大学医学院第一附属医院普通外科;西安交通大学医学院第二附属医院普通外科;陕西省人民医院麻醉科;
【关键词】： 缺氧 端粒酶 慢病毒载体 基因治疗 结直肠癌
【基金】：国家自然科学基金资助项目(项目编号:81101874;项目编号:81172362) 陕西省科学技术研究发展计划项目(项目编号:2011-K12-19) 陕西省科技统筹创新工程计划项目(项目编号:2013KTCQ03-08)~~
【分类号】：R346
【正文快照】： 结直肠癌是世界范围内的高发肿瘤,其死亡率在恶性肿瘤中排第3位[1-2]。在我国,结直肠癌为发病率第3高的恶性肿瘤,死亡率居第4位[3]。一直以来,以手术为主的综合治疗是结直肠癌治疗的首要措施,近年来,随着基因治疗的发展,为结直肠癌的治疗增添了新的方法[4-6],改善了预后,但与

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本文编号：865331