Resistin与肥胖性2型糖尿病恒河猴模型相关性及其参与病理发生的分子机制研究

发布时间：2017-09-17 21:31

  本文关键词：Resistin与肥胖性2型糖尿病恒河猴模型相关性及其参与病理发生的分子机制研究

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【摘要】：目的：抵抗素(Resistin,RETN)是一类由脂肪细胞特异性分泌的激素样脂肪细胞因子,是2型糖尿病(T2DM)胰岛素抵抗治疗的一个潜在靶点。由于目前其基因功能和生物学特性还没有完全清楚,而且在参与胰岛素抵抗中的生物学功能的研究结果发生了分歧,因而我们选用与人类较为接近的恒河猴作为研究对象,对Resistin与T2DM的相关性和参与病理发生的分子机制进行初步探索。方法：用高糖高脂饮食诱导肥胖性T2DM恒河猴模型,对其血清Resistin水平进行测定,并进行与T2DM部分临床指标以及胰岛素敏感性相关性分析。随后克隆恒河猴Resistin的全长基因开放阅读框,并将其构建在慢病毒载体上。将重组慢病毒感染人肝癌细胞Huh-7,并通过基因芯片技术筛选受表达调控的基因和信号转导通路。结果：Resistin与肥胖性T2DM恒河猴的总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇、空腹血糖、空腹胰岛素、糖化血红蛋白、胰岛素抵抗指数存在正相关性,而与胰岛β细胞功能存在负相关性。通过慢病毒介导恒河猴Resistin在Huh-7细胞中的过表达,并运用基因芯片筛选到了与cAMP信号通路相关的IL6、VIP等15个基因受到了Resistin的调控,包括诱导细胞凋亡、促进肝糖原分解、促炎症和影响胰岛素敏感性的基因。结论：Resistin与T2DM密切相关,可能通过cAMP第二信使激活下游的信号通路(MAPK、ERK、AKT等)调控促炎症因子、细胞凋亡因子等的表达,从而启动细胞氧化应急反应诱导功能细胞凋亡并负向参与和干扰了T2DM机体糖代谢的过程。
【关键词】：2型糖尿病 抵抗素 胰岛素抵抗 基因芯片
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1;R589.2;R-332
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstact8-10
• 前言10-13
• 第一部分 血清Resistin与肥胖性T2DM恒河猴模型的相关性分析13-36
• 一、肥胖性T2DM恒河猴模型的构建13-26
• 1 实验材料13-14
• 1.1 实验动物13
• 1.2 饲料配方13-14
• 1.3 试剂与耗材14
• 1.4 仪器设备14
• 2 实验方法14-17
• 2.1 高糖高脂饮食诱导恒河猴高脂血症和肥胖症14-15
• 2.2 低剂量STZ诱发肥胖性T2DM恒河猴模型及评价15-16
• 2.3 组织病理学检测16-17
• 3 结果17-25
• 3.1 体重、血脂、空腹血糖、胰岛素、C肽以及胰岛素抵抗指数临床指标监测结果17
• 3.2 葡萄糖耐量试验和胰岛素耐受试验17-21
• 3.3 尿糖的定性检测21-22
• 3.4 T2DM胰岛素抵抗相关细胞因子Resistin检测22
• 3.5 胰腺、肝脏和肾脏的组织病理学分析22-24
• 3.6 胰岛组织病理学分析24
• 3.7 肝脏组织糖原染色分析结果24-25
• 4 讨论25-26
• 二、血清Resistin与肥胖性T2DM临床指标的相关性分析及其在糖代谢中的释放特征26-36
• 1 实验材料26-27
• 1.1 实验动物26-27
• 1.2 试剂与耗材27
• 1.3 仪器设备27
• 2 实验方法27-28
• 2.1 诱导T2DM模型27-28
• 2.2 血清Resistin与T2DM恒河猴模型的血脂、血糖、糖化血红蛋白、胰岛素、胰岛素抵抗指数和β细胞功能的相关性分析28
• 2.3 血清Resistin在T2DM恒河猴模型葡萄糖代谢过程中的变化28
• 3 结果28-34
• 3.1 T2DM猴血脂、血糖、糖化血红蛋白、胰岛素等指标检测结果28-29
• 3.2 血清Resistin与T2DM恒河猴模型的血脂、血糖、糖化血红蛋白、胰岛素、胰岛素抵抗指数和β细胞功能的相关性分析结果29-31
• 3.3 葡萄糖耐量试验31
• 3.4 在葡糖糖耐量试验中对血糖、胰岛素和Resistin释放的变化曲线AUC计算结果31
• 3.5 对照组与T2DM组的组内比较31-34
• 4 讨论34-36
• 第二部分 恒河猴Resistin基因的克隆与慢病毒载体的构建36-58
• 一、恒河猴Resistin基因克隆及分析36-46
• 1 实验材料36-37
• 1.1 实验动物36
• 1.2 试剂与耗材36-37
• 1.3 仪器设备37
• 2 实验方法37-41
• 2.1 引物设计与合成37
• 2.2 总RNA的提取37-38
• 2.3 cDNA的合成38
• 2.4 恒河猴Resistin基因的扩增38-39
• 2.5 胶回收PCR产物39-40
• 2.6 酶切,连接和转化40-41
• 2.7 提取质粒41
• 2.8 用XbaI和PstI双酶切鉴定.41
• 2.9 测序及序列分析41
• 3 结果41-46
• 3.1 脂肪组织和胰腺组织总RNA抽提及检测结果41-42
• 3.2 Resistin基因的PCR扩增结果42
• 3.3 Resistin基因克隆及鉴定结果42-44
• 3.4 测序及序列分析结果44-46
• 二、恒河猴Resistin重组慢病毒载体的构建及包装46-58
• 1 实验材料46-47
• 1.1 质粒、菌株及细胞46
• 1.2 试剂与耗材46
• 1.3 仪器设备46-47
• 1.4 PCR引物设计与合成47
• 2 实验方法47-50
• 2.1 macRETN-PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro重组质粒的建立47-48
• 2.2 293T细胞的复苏48
• 2.3 293T细胞的传代48
• 2.4 慢病毒载体的转染48-49
• 2.5 携带macRETN基因重组慢病毒颗粒的电镜检测49
• 2.6 qPCR法测定慢病毒滴度49-50
• 3 结果50-57
• 3.1 macRETN ORF扩增结果50
• 3.2 macRETN-PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro重组质粒酶切及测序鉴定结果50-52
• 3.3 macRETN-PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro慢病毒颗粒的包装及收获52
• 3.4 携带macRETN基因重组慢病毒的滴度测定结果52-55
• 3.5 携带macRETN基因重组慢病毒颗粒的电镜检测结果55
• 3.6 携带macRETN基因重组慢病毒在293T细胞中的感染效率55
• 3.7 macRETN基因在293T细胞中mRNA水平的表达检测结果55-57
• 4 讨论57-58
• 第三部分 恒河猴Resistin对人肝细胞葡萄糖代谢的调控58-75
• 1 实验材料58-59
• 1.1 细胞株58
• 1.2 试剂与耗材58
• 1.3 仪器设备58-59
• 1.4 引物59
• 2 实验方法59-65
• 2.1 Huh-7细胞的复苏59-60
• 2.2 Huh-7细胞的传代60
• 2.3 Huh-7细胞的冻存60-61
• 2.4 慢病毒转染61
• 2.5 PCR检测61
• 2.6 葡萄糖吸收实验61
• 2.7 用 Qiagen RNeasy® Mini Kit 和 RNase-Free DNase Set试剂盒提取细胞的 RNA61-62
• 2.8 Qiagen RT2 First Strand 试剂盒反转录第一条 cDNA62-63
• 2.9 cDNA浓度的测定63-64
• 2.10 基因芯片分析64-65
• 2.11 差异基因的显著性分析65
• 3 结果65-71
• 3.1 macRETN重组慢病毒感染Huh-7人肝细胞对报告基因eGFP荧光检测结果65
• 3.2 PCR检测结果65
• 3.3 葡萄糖吸收实验65-68
• 3.4 cDNA浓度的测定68
• 3.5 实时定量PCR特异性检验68-69
• 3.6 基因芯片的数据的质量控制69
• 3.7 看家基因的选择结果69
• 3.8 基因芯片的差异性基因分析69-71
• 3.9 基因的差异显著性分析71
• 4 讨论71-75
• 小结75
• 展望75-76
• 参考文献76-83
• 附录83-88
• 一、缩略词83-85
• 二、主要溶液及培养基的配制85-88
• 个人简历88-89
• 致谢89-90

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 钱荣立;关于糖尿病新诊断标准与分型的意义[J];临床内科杂志;2000年03期

2 陈浩宇;王水明;彭瑞云;高亚兵;王丽峰;赵黎;左红艳;董霁;苏镇涛;;微波长期辐射对雄性生殖的影响研究[J];中华男科学杂志;2011年03期

3 陈丽萌,李学旺,黄利伟,李艳,段琳,张小娟;2型糖尿病小鼠(KKA~y)动物模型的鉴定和早期肾脏病理改变[J];中国医学科学院学报;2002年01期

4 朱华宇;张翔;张晓;张瑞;杨安钢;;miR-203真核表达载体的构建和重组慢病毒的制备及其对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响[J];细胞与分子免疫学杂志;2013年06期

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本文编号：871472