日本血吸虫两种酪氨酸酶的克

发布时间：2017-09-19 23:17

  本文关键词：日本血吸虫两种酪氨酸酶的克隆、表达和转录特异性分析

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【摘要】：目的克隆、表达日本血吸虫2种酪氨酸酶SjTYR1和SjTYR2的全长基因,并研究这2种基因在日本血吸虫不同性别和不同发育阶段的转录特异性。方法设计特异性引物,从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增出SjTYR1和SjTYR2的全长片段,并克隆入原核表达载体pSJ2,验证正确的重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)Rosetta Gami细胞,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并用组氨酸标签对表达产物进行亲和层析纯化。将纯化后获得的重组蛋白SjTYR1和SjTYR2分别免疫新西兰白兔制备免疫兔血清。分别以重组蛋白免疫兔血清和日本血吸虫感染兔血清为一抗,用蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫原性和免疫反应性;以重组蛋白免疫兔血清为一抗,用Western blotting观察其与日本血吸虫虫体蛋白的反应情况。制备感染后14、16、18、20、22、24、26和28 d雌虫和雄虫的总RNA,利用RT-PCR分析SjTYR1和SjTYR2基因在日本血吸虫不同性别及不同发育时间的转录水平的差异。结果构建了重组原核表达载体SjTYR1/pSJ2和SjTYR2/pSJ2,诱导后获得包涵体形式表达的重组蛋白,相对分子质量(Mr)分别为55 000和56 800,与预测的融合蛋白相对分子质量相符。纯化后的重组蛋白SjTYR1可被日本血吸虫感染兔血清识别,而SjTYR2则不能。rSjTYR1免疫兔血清与虫体蛋白反应后,可见一条约Mr100 000的条带,rSjTYR2免疫兔血清不与虫体蛋白反应。在雄虫体内,2种酪氨酸酶均不转录;在雌虫体内,2种酪氨酸酶在感染后24 d内不转录,自24 d开始出现激增,之后逐渐提高,感染后28 d达到相对最大值。结论构建了SjTYR1和SjTYR2的重组质粒并表达,2种重组蛋白均具有免疫原性和免疫反应性。SjTYR1和SjTYR2在血吸虫雌虫中特异表达,且在感染终宿主后24~28 d转录水平升高。
【作者单位】： 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室;中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室 世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心;复旦大学生命科学学院微生物学与微生物工程系;
【关键词】： 日本血吸虫 酪氨酸酶 克隆 表达 转录特异性
【基金】：国家传染病科技重大专项(No.2009ZX1004-302)~~
【分类号】：R383.24
【正文快照】： 血吸虫病被认为是一种免疫性疾病[1]。血吸虫雌虫产卵沉积在宿主组织器官并诱导宿主产生免疫病理反应是血吸虫致病的一个重要因素[2]。吸虫类虫卵的形成依靠交联蛋白的硬化和鞣制[3,4],酪氨酸酶在蛋白交联中发挥关键的催化作用。酪氨酸酶是一种铜离子螯合酶,催化单酚临位羟基

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7 钱e，

本文编号：884498