乙肝表面抗体亲和力成熟的实验研究

发布时间：2017-09-20 07:41

  本文关键词：乙肝表面抗体亲和力成熟的实验研究

  更多相关文章： 乙型肝炎抗体 亲和力成熟 结构生物学 同源模建法 分子对接法

【摘要】：乙型肝炎作为全球十大致死性疾病之一，严重影响人类的生命健康。现阶段对于乙型肝炎来说还是预防为主，各类抗病毒药物的应用并没有取得令人满意的效果。但是，抗乙型肝炎病毒抗体的出现对乙型肝炎产生有效的防治作用，为乙型肝炎的防治带来新的希望。随着基因工程技术和结构生物学的飞速发展，对抗体的研究和应用起到了巨大的推进作用。通过基因工程技术改造的抗体虽然具有较好的特异性，但是操作繁琐，工作量大。结构生物学的发展有效的弥补了基因工程技术在抗体改造中的不足，可以通过计算机模拟技术对基因工程抗体的亲和力进行计算，减少突变抗体的数量，并进行进一步的优化。 本课题通过计算机模拟技术对已获得的乙肝表面抗体亲和力进行优化，并通过生物学实验对其亲和力进行验证。我们首先利用生物信息学方法研究了乙肝病毒表面抗原M（Middle Hepatitis B SurfaceAntigen, MHBsAg）和目标抗体的序列特征，并从已有的数据库中分别找到了与之同源性较高、质量比较好的晶体结构。接着，利用同源模建技术以晶体结构1WZ4为模板构建了目标病毒MHBsAg表位的三维结构，以晶体结构4JDT中的H链和晶体结构4KMT中L链为模板同源模建了目标抗体的重链和轻链，参考晶体结构1F11中抗体轻链和重链的组装方式构建了目标抗体的三维结构。然后，利用分子力学技术，先后通过最陡下降法和共轭沉降法两步对预测得到的MHBs Ag表位和抗体复合物结构进行了适度优化。接着，通过分子对接技术将优化后的MHBsAg表位与目标抗体结构进行蛋白质 蛋白质分子对接，优选出了目标病毒MHBsAg表位与目标抗体的较好的结合方式。该结合模式中MHBs Ag表位的一个螺旋部分镶嵌在轻、重两条链的loop区中间，MHBsAg的两个螺旋所形成的角度也尽可能多地把重链的CDR3区包住，增大了抗原 抗体之间的相互作用，增强了抗体对抗原的识别，这些与之前的文献调研结果相符合。 在对抗原 抗体复合物进行了适度优化之后，，我们对二者之间的相互作用进行了结构分析。在这个结合状态中，MHBs Ag能够很好的嵌入到抗体复合物轻链和重链CDR3区形成的凹槽中间，并与之进行充分地接触，在二者之间共产生了8个氢键相互作用，1个盐桥相互作用和1个阳离子 π相互作用。在氢键相互作用中，抗体轻链参与的氨基酸主要有两个，Arg30和Tyr32，重链参与的氨基酸主要有4个，Tyr32、Arg98、Gln108和Tyr109，而MHBsAg表位参与的氨基酸有8个，Asn1、Ser2、Gln4、Phe5、His6、Tyr18、Gly22和Gly23。以这些相互作用为线索，对抗体轻链上的Arg30，Ala50和重链上的Arg98进行饱和突变，通过计算获得了突变前后的自由能变化图谱。将这三个位点联合突变为结合能最大的氨基酸残基，构建抗体突变体并诱导表达，对其活性鉴定发现联合突变体的亲和力明显高于未经过结构优化的抗体。 综上所述，本课题通过计算机模拟技术实现了对乙型肝炎表面抗体结构的优化，并且通过生物学方法证明经过结构优化的抗体亲和力确实得到了明显的提升。为全人源化乙型肝炎表面抗体的临床应用奠定了基础。
【关键词】：乙型肝炎抗体 亲和力成熟 结构生物学 同源模建法 分子对接法
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 中英文缩略词11-12
• 第1章 绪论12-25
• 1.1 抗体的研究进展12-19
• 1.1.1 抗体的结构和功能12-13
• 1.1.2 抗体的发展历程13-16
• 1.1.3 抗体在疾病治疗中的应用16-19
• 1.2 乙型肝炎免疫治疗的研究进展19-21
• 1.3 结构生物学的研究进展21-23
• 1.3.1 蛋白质结构的预测21-22
• 1.3.2 计算机模拟的分子对接技术22
• 1.3.3 结构生物学对抗体工程的影响22-23
• 1.4 立题依据23-25
• 第2章 乙肝表面抗体亲和力成熟的实验研究25-47
• 2.1 实验材料25-26
• 2.1.1 实验仪器25
• 2.1.2 实验材料25-26
• 2.1.3 引物26
• 2.2 实验方法26-33
• 2.2.1 利用 Discovery Studio 计算机模拟平台对乙肝表面抗体进行改造和优化26-27
• 2.2.2 高亲和力抗体突变体重组表达载体的构建27-29
• 2.2.3 重组抗体在酵母中的表达和亲和力鉴定29-33
• 2.3 实验结果33-44
• 2.3.1 乙型肝炎表面抗体结构模拟突变，初步分析及序列选择33-34
• 2.3.2 以 1WZ4 为模板，利用同源模建的方法构建序列已知的MHBs Ag 的 123 145 位氨基酸结构34-35
• 2.3.3 利用同源模建的方法构建抗体结构35-36
• 2.3.4 利用能量最小化对构建得到的 MHBs Ag 以及抗体结构进行充分优化36-37
• 2.3.5 预测目标病毒 MHBs Ag 与抗体 CDR 区可能的相互作用模式37
• 2.3.6 目标病毒 MHBs Ag 抗体的相互作用模式进行优选37-38
• 2.3.7 利用能量最小化对该相互作用模式进行充分优化38-39
• 2.3.8 分析相互作用模式特征，找到参与相互作用的关键氨基酸39-41
• 2.3.9 关键氨基酸位点饱和突变后对抗体结合能力的影响41-42
• 2.3.10 重链及轻链抗体突变体重组表达载体的构建42
• 2.3.11 轻链抗体转化酵母的基因鉴定42-43
• 2.3.12 完整抗体突变体转化酵母的基因鉴定43
• 2.3.13 重组抗体突变体亲和活性的变化43-44
• 2.4 讨论44-47
• 第3章 研究总结47-48
• 参考文献48-54
• 作者简介54-55
• 致谢55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 ;Recombinant anti-HBsAg Fab blocks hepatitis B virus infection after orthotopic liver transplantation[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2007年04期

2 Zhi-Jian Lu;Su-Jun Deng;Da-Gang Huang;Yun He;Ming Lei;Li Zhou;Pei Jin;;Frontier of therapeutic antibody discovery:The challenges and how to face them[J];World Journal of Biological Chemistry;2012年12期

本文编号：886780