Integrins在间充质干细胞向内皮细胞分化中的作用研究

发布时间：2017-09-26 16:21

  本文关键词：Integrins在间充质干细胞向内皮细胞分化中的作用研究

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【摘要】：体内外的研究证实间充质干细胞(MSCs)可以向内皮细胞分化,为血管组织工程提供种子细胞。实验室前期工作已证实VEGF可以诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向内皮细胞分化。Integrins(整合素)在血管内皮细胞中有高表达,对血管生成起重要作用。本论文拟研究Integrins在VEGF诱导的骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化及其血管生成过程中的作用。首先用50 ng/mL VEGF诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,利用LDL吸收实验证实骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞,能吸收DiI-Ac-LDL;然后通过Matrigel基质胶成血管实验证实骨髓间充质干细胞的血管生成能力；利用RT-PCR和Western blot的方法检测Integrins (Integrin α1、Integrin α5、Integrin αV、Integrin β1、Integrin β4、 Integrin β5)表达随着诱导时间的增长有上升趋势。前期实验已证实Rho信号通路参与VEGF的诱导过程,因此为了验证Integrins是否受到Rho信号通路的调控,本实验分别利用两种Rho信号通路抑制剂2 μg/mL C3或10 μmol/L Y27632对细胞进行预处理,然后用VEGF诱导分化。结果发现,骨髓间充质干细胞不能分化为内皮细胞,且血管生成能力下降,Integrins的表达下降。已有研究证实Rho信号通路的活化会引起MRTF-A入核并激活下游靶基因,为进一步确定Integrins是否会受到MRTF-A的调控,通过在骨髓间充质干细胞中分别转染sh-MRTF-A干扰质粒和合成的siMRTF-A抑制内源性MRTF-A功能,然后用VEGF诱导分化。结果显示,干扰MRTF-A组的骨髓间充质干细胞不能分化为内皮细胞,且血管生成能力下降,Integrins的表达也下降。利用划痕实验和Transwell迁移小室实验证实骨髓间充质干细胞的迁移能力下降。进一步通过荧光素酶报告基因分析实验,证实MRTF-A对于Integrin α1和Integrin α5启动子有转录激活作用。最后利用人脐静脉血内皮细胞系(HUVECs)进一步证实了MRTF-A对Integrins的调控作用。在HUVEC细胞中转染siMRTF-A后再用VEGF处理。利用MTT检测到干扰MRTF-A对细胞的增殖没有显著影响。鬼笔环肽染色、划痕、transwell及matrigel实验证实低表达MRTF-A的细胞粘附、迁移和血管生成能力均下降,细胞迁移特异性标志物MYL9和CYR61以及Integrins的表达降低。最后证实了MRTF-A对于Integrin α1和Integrin α5启动子有转录激活作用。
【关键词】：间充质干细胞 内皮细胞 Integrins 血管内皮生长因子 MRTF-A Rho
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-5
• abstract5-9
• 1 前言9-23
• 1.1 组织工程化血管的简介9-10
• 1.1.1 组织工程9
• 1.1.2 血管组织工程9-10
• 1.1.3 血管内皮细胞10
• 1.2 间充质干细胞10-13
• 1.2.1 间充质干细胞简介10-11
• 1.2.2 骨髓间充质干细胞11-12
• 1.2.3 国内外研究现状12-13
• 1.3 VEGF13-15
• 1.3.1 VEGF及其受体简介13-14
• 1.3.2 VEGF及其受体的功能14
• 1.3.3 VEGF诱导间充质干细胞向内皮细胞分化的研究现状14-15
• 1.4 Integrins15-16
• 1.4.1 Integrins简介15-16
• 1.4.2 Integrins在间充质干细胞向内皮细胞分化中的作用16
• 1.5 Rho信号通路16-18
• 1.6 MRTF-A18-20
• 1.6.1 MRTF-A的结构18-19
• 1.6.2 MRTF-A的研究现状19-20
• 1.7 研究目的及意义20-21
• 1.8 研究的主要内容21-23
• 2 材料与方法23-48
• 2.1 实验材料23-30
• 2.1.1 实验细胞、动物、质粒和菌株23
• 2.1.2 实验仪器及设备23-24
• 2.1.3 实验试剂及耗材24-26
• 2.1.4 常用溶液的配置26-30
• 2.2 实验方法30-48
• 2.2.1 骨髓间充质干细胞的提取与培养30-31
• 2.2.2 人脐静脉血内皮细胞(HUVEC)和COS7细胞的培养31-32
• 2.2.3 细胞转染32-34
• 2.2.4 DiI-Ac-LDL吸收实验34
• 2.2.5 Matrigel基质胶成血管实验34
• 2.2.6 细胞划痕实验34-35
• 2.2.7 Transwell实验35-36
• 2.2.8 RT-PCR检测36-38
• 2.2.9 蛋白质免疫印记(Western Blot)38-39
• 2.2.10 Integrins启动子质粒构建39-44
• 2.2.11 MTT检测细胞增殖44-45
• 2.2.12 鬼笔环肽染色实验45-46
• 2.2.13 荧光素酶活性检测(Luciferase)46-47
• 2.2.14 统计分析方法47-48
• 3 结果与讨论48-70
• 3.1 骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化过程中Integrins的影响48-50
• 3.1.1 建立骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的模型48
• 3.1.2 VEGF诱导BMSCs的血管生成实验48-49
• 3.1.3 BMSCs向内皮细胞分化过程中IntegrinsmRNA水平的表达49-50
• 3.1.4 BMSCs向内皮细胞分化过程中Integrins蛋白水平的表达50
• 3.2 Rho信号通路参与VEGF的诱导过程并调控Integrins50-53
• 3.2.1 Rho信号通路对VEGF诱导分化的影响50-51
• 3.2.2 Rho信号通路参与VEGF诱导的BMSCs的血管生成51-52
• 3.2.3 Rho信号通路对VEGF诱导过程中IntegrinsmRNA水平表达的影响52
• 3.2.4 Rho信号通路对VEGF诱导过程中Integrins蛋白水平表达的影响52-53
• 3.3 MRTF-A参与VEGF诱导BMSCs向内皮细胞分化的过程53-63
• 3.3.1 MRTF-A对VEGF诱导分化的影响53-54
• 3.3.2 MRTF-A参与VEGF诱导的BMSCs的迁移54-56
• 3.3.3 MRTF-A参与VEGF诱导的BMSCs的血管生成56-57
• 3.3.4 MRTF-A对VEGF诱导分化过程中IntegrinsmRNA水平表达的影响57-58
• 3.3.5 MRTF-A对VEGF诱导分化过程中Integrins蛋白水平表达的影响58
• 3.3.6 MRTF-A对Integrin α1和Integrin α5启动子活性的影响58-63
• 3.4 MRTF-A对HUVEC细胞的作用63-70
• 3.4.1 MRTF-A对HUVEC细胞增殖的影响63-64
• 3.4.2 MRTF-A对HUVEC细胞粘附的影响64-65
• 3.4.3 MRTF-A对HUVEC细胞迁移的影响65-67
• 3.4.4 MRTF-A对HUVEC细胞成血管的影响67-68
• 3.4.5 MRTF-A对HUVEC细胞中Integrins的表达的影响68
• 3.4.6 HUVEC细胞中Integrin α1和Integrin α5启动子荧光素酶活性分析68-70
• 4 结论70-71
• 5 展望71-72
• 6 参考文献72-78
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况78-79
• 8 致谢79

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本文编号：924536