PHO4、HAP2基因参与白念珠菌唑类药物耐受的调控机制研究

发布时间：2017-09-27 05:29

  本文关键词：PHO4、HAP2基因参与白念珠菌唑类药物耐受的调控机制研究

  更多相关文章： 白念珠菌 药物敏感性 氧化应激 线粒体呼吸 铁代谢

【摘要】：研究目的:利用白念珠菌转录因子缺失菌库,筛选不同缺失菌对抗真菌药物敏感性差异,发现对药物敏感性产生显著影响的转录因子,进而考察该转录因子对白念珠菌药物敏感性的影响作用及调控机制。研究方法:通过微量液基稀释法、点板实验(Spot Assay)进行白念珠菌转录因子缺失菌的药物敏感性的筛选。采用实时定量PCR(Realtime-PCR)的方法检测白念珠菌转录因子缺失菌中与耐药性相关的外排泵等相关基因的转录水平,并通过罗丹明6G外排实验,进一步考察白念珠菌外排泵活性。通过测定胞内ATP水平和线粒体膜电位,考察药物外排泵活性改变是否与线粒体呼吸功能及能量代谢异常有关。利用铁离子螯合剂红菲绕啉(BPS)考察缺失菌株铁代谢情况。通过生长曲线法考察菌株对活性氧类物质H2O2的敏感性,并测定胞内活性氧水平。Realtime-PCR实验考察抗氧化相关基因的表达并检测菌株胞内还原酶活性。实验结果:通过药物敏感性筛选发现,与亲本菌SN250相比,pho4△/△和hap2△/△对唑类药物的敏感性显著增加。pho4△/△对唑类抗真菌药敏感,对罗丹明外排能力减弱,但耐药相关基因CDR1,MDR1以及ERG11的表达却有所增加。进一步考察发现,pho4△/△对H2O2的敏感性显著增加,菌株抵抗氧化应激的能力下降,胞内活性氧水平下降。考察突变株的线粒体功能,发现ATP含量下降,线粒体膜电位略升高。HAP2基因缺失导致白念珠菌对抗真菌药物的敏感性增高,药物外排泵编码基因CDR1,MDR1以及耐药相关基因ERG11转录水平下降,突变株对罗丹明6G外排能力降低,即药物外排泵活性下降。HAP2基因缺失导致菌株在缺铁环境中生长减慢,胞内铁离子含量降低。缺失了HAP2基因的菌株,线粒体呼吸链复合物Ⅱ主要成分琥珀酸脱氢酶编码基因SDH2表达下降,胞内ATP水平和线粒体膜电位均降低,菌株能量代谢异常,胞内ROS浓度与野生型没有差异,但与铁离子匮乏相一致的是,在咪康唑诱导下,其ROS产生的能力显著低于野生型,同时,抗氧化基因SOD4,GLR1,TRR1以及胞内GSH含量显著增高。结论:转录因子Pho4的缺失可能通过降低白念珠菌的抗氧化应激能力,减弱对药物的外排作用而导致对唑类药物敏感,但其具体的调控机制有待进一步研究。HAP2基因是铁代谢相关的重要转录因子,该基因缺失导致白念珠菌铁离子摄取降低,铁代谢异常。由于铁离子是众多酶促反应的辅助离子,在缺失HAP2基因的白念珠菌中,菌株能量代谢异常,ATP产生减少,进而减少了ABC转运蛋白、易化扩散超家族蛋白转运所需的能量,最终导致突变株对唑类药物的敏感性增加。与此同时,咪康唑诱导下的胞内活性氧形成能力降低与铁离子匮乏呈正相关,HAP2缺失菌中胞内活性氧没有差异,但在咪康唑诱导下,其活性氧形成能力降低,菌株胞内抗氧化还原基因转录水平升高,还原酶活性增高。
【关键词】：白念珠菌 药物敏感性 氧化应激 线粒体呼吸 铁代谢
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R379.4
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略词表10-12
• 前言12-17
• 第一部分：对白念珠菌转录因子缺失菌库进行药物敏感性筛选和生物信息学分析17-29
• 一、材料与方法17-24
• 二、实验结果24-27
• 三、讨论27-29
• 第二部分：转录因子Pho4p影响白念珠菌药物敏感性的机制研究29-45
• 一、材料与方法29-36
• 二、实验结果36-43
• 三、讨论43-45
• 第三部分：转录因子Hap2p参与白念珠菌药物敏感性的调控机制45-62
• 一、材料与方法45-51
• 二、实验结果51-60
• 三、讨论60-62
• 总结62-63
• 参考文献63-66
• 文献综述66-96
• References85-96
• 在读期间参加科研工作情况96-97
• 致谢97

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本文编号：927891