产3-羟基丙酸肺炎克雷伯氏菌基因表达调控元件的研究

发布时间：2017-10-07 05:27

  本文关键词：产3-羟基丙酸肺炎克雷伯氏菌基因表达调控元件的研究

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【摘要】：3-羟基丙酸(3-HP)作为重要的平台化合物,有着广阔的市场前景。Klebsiella pneumoniae因其较高的甘油耐受性、较强的甘油代谢能力、发酵周期短等特点成为利用甘油生物法生产3-HP的优势宿主菌。但由于可用启动子相对较少,且少数已知可用的启动子转录活性相对较弱,造成3-HP的生产过程转化率较低。本研究针对这一问题进行探索,通过构建K. pneumoniae高效表达系统,对K. pneumoniae甘油代谢途径进行改造,实现3-HP的高产。1、选择K. pneumoniae中13个生长代谢必需基因的启动子构建组成型启动子库,利用GFP报告系统对启动子进行筛选,获得了具有较高转录活性的组成型启动子Pkan,该表达系统无需加入诱导剂即可实现相对恒定的高效表达,其转录活性约为K. pneumoniae常用表达系统pET-pk的1.7倍,且对菌体的生长代谢影响较小,可用于构建K. pneumoniae高效组成型表达系统。2、为提高3-HP产量,利用Pkan过表达来自Escherichia coli醛脱氢酶基因aldH,构建的重组菌可实现甘油到.3-HP的高效转化。重组菌的摇瓶发酵数据表明,3-HP产量为0.47g/L,与野生菌相比提高了89.5%,与具有相同代谢负荷的空质粒对照菌相比增加了238%。上罐发酵实验,目的产物的产量为15.28g/L,甘油转化率达13.02%,时空产率为0.57 g·L-·h-1。3、为提高启动子的转录活性,对tac启动子核心序列进行串联获得复合启动子。利用此表达系统过表达醛脱氢酶基因puuC,构建的重组菌可实现3-HP的高产。重组菌摇瓶发酵结果表明重组菌K.p(pETP3core-tac-puuC)、K. p(pETP5core-tac-puuC)的3-HP产量分别为2.88g/L、3.10g/L。上罐发酵结果表明,3-HP的终产量分别为99.8 g/L81.4g/L；甘油转化率分别是87.7%,69.3%；时空产率分别为1.04g·L-1·h-1,1.36g·L-1·h-1。重组菌K.p(pETP3core-tac-puuC)的3-HP产量为目前报道最高,且在发酵结束时,乳酸的产量接近0g/L,这对于3-HP的实际生产具有十分重要的意义。
【关键词】：3-羟基丙酸 肺炎克雷伯氏菌 复合启动子 组成型表达系统 醛脱氢酶 甘油
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-18
• 第一章 绪论18-30
• 1.1 3-羟基丙酸的研究概述18-24
• 1.1.1 性质及应用18
• 1.1.2 3-羟基丙酸的生产18-19
• 1.1.3 生物合成法生产3-羟基丙酸19-21
• 1.1.4 基因工程菌生产3-羟基丙酸21-22
• 1.1.5 基因工程菌产3-羟基丙酸研究进展22-23
• 1.1.6 K. pneumoniae中的甘油代谢途径23-24
• 1.2 启动子筛选24-27
• 1.2.1 启动子概述24-25
• 1.2.2 启动子工程25-26
• 1.2.3 启动子筛选26-27
• 1.3 复合启动子27
• 1.4 本课题研究意义27-30
• 第二章 K.pneumoniae高效表达系统的构建30-46
• 2.1 引言30
• 2.2 实验材料30-32
• 2.2.1 菌株和载体30
• 2.2.2 主要试剂及仪器30-31
• 2.2.3 培养基31-32
• 2.3 试验方法32-37
• 2.3.1 基因组模板的提取32
• 2.3.2 质粒载体的提取32-33
• 2.3.3 组成型启动子片段的克隆33
• 2.3.4 目的基因PCR产物回收33-34
• 2.3.5 组成型表达载体的构建34
• 2.3.6 组成型表达载体的鉴定34-35
• 2.3.7 报告基因GFP的克隆35
• 2.3.8 以GFP为报道基因的重组质粒的构建35-36
• 2.3.9 以GFP为报道基因的重组质粒的鉴定36
• 2.3.10 K.pneumoniae感受态细胞制备及电转化36-37
• 2.3.11 重组菌的筛选与鉴定37
• 2.3.12 重组菌的发酵培养37
• 2.4 结果与讨论37-43
• 2.4.1 K.pneumoniae DSM2026基因组的提取37-38
• 2.4.2 组成型启动子基因的克隆38-39
• 2.4.3 组成型表达载体的构建与鉴定39-40
• 2.4.4 报告基因GFP的克隆40
• 2.4.5 以GFP为报道基因的重组质粒的构建与鉴定40-41
• 2.4.6 重组菌的构建与鉴定41-42
• 2.4.7 重组菌荧光强度测定42-43
• 2.5 本章小结43-46
• 第三章 利用组成型表达系统生产3-HP的研究46-60
• 3.1 引言46
• 3.2 实验材料46-47
• 3.2.1 菌株和载体46
• 3.2.2 主要试剂及仪器46-47
• 3.2.3 培养基47
• 3.3 试验方法47-51
• 3.3.1 获取基因组47
• 3.3.2 目的基因aldH的克隆47-48
• 3.3.3 重组质粒(pETP_(kan)-aldH)的构建48-49
• 3.3.4 重组质粒(pETP_(kan)-aldH)的鉴定49
• 3.3.5 K.pneumoniae感受态细胞制备及电转化49
• 3.3.6 重组菌K.p(pETPkan-aldH)的筛选与鉴定49
• 3.3.7 重组菌微氧摇瓶发酵49-50
• 3.3.8 重组菌微氧批式流加发酵50
• 3.3.9 重组菌生长曲线绘制50
• 3.3.10 甘油剩余量的测定50
• 3.3.11 重组菌3-HP及副产物产量50-51
• 3.3.12 重组菌aldH基因的表达51
• 3.3.13 重组菌酶活测定51
• 3.4 结果与讨论51-58
• 3.4.1 E.coli DH5α基因组提取51-52
• 3.4.2 目的基因aldH的克隆52
• 3.4.3 重组质粒pETP_(kan)-aldH的鉴定52-53
• 3.4.4 重组菌K. p(pETP_(kan)-aldH)的鉴定53-54
• 3.4.5 重组菌醛脱氢酶的表达54
• 3.4.6 重组菌醛脱氢酶的酶活测定54-55
• 3.4.7 重组菌微氧摇瓶发酵产3-HP55-57
• 3.4.8 重组菌上罐发酵57-58
• 3.5 本章小结58-60
• 第四章 利用复合启动子构建高效表达系统生产3-HP60-76
• 4.1 引言60
• 4.2 实验材料60-61
• 4.2.1 菌株和载体60
• 4.2.2 主要试剂及仪器60-61
• 4.2.3 培养基61
• 4.3 试验方法61-66
• 4.3.1 K. pneumoniae基因组的提取61
• 4.3.2 目的基因puuC的克隆61-62
• 4.3.3 质粒pET-puuC的构建62
• 4.3.4 质粒pET-puuC的鉴定62-63
• 4.3.5 目的片段Pntac的合成63
• 4.3.6 重组质粒pETPntac-puuC的构建63-64
• 4.3.7 重组质粒pETPntac-puuC的鉴定64
• 4.3.8 K.pneumoniae感受态细胞制备及电转化64
• 4.3.9 重组菌K p(pETPntac-puuC)的筛选与鉴定64
• 4.3.10 重组菌微氧摇瓶发酵64-65
• 4.3.11 重组菌微氧批式流加发酵65
• 4.3.12 重组菌生长曲线绘制65
• 4.3.13 甘油剩余量的测定65
• 4.3.14 重组菌3-HP及副产物产量65
• 4.3.15 重组菌酶活测定65-66
• 4.4 结果与讨论66-74
• 4.4.1 目的基因puuC的克隆66
• 4.4.2 质粒pET-puuC的鉴定66-67
• 4.4.3 重组质粒pETPncore-tac-puuC的测序鉴定67
• 4.4.4 重组菌K. pneumoniae(pETPncore-tac-puuC)鉴定67-68
• 4.4.5 重组菌微氧摇瓶发酵产3-HP68-71
• 4.4.6 重组菌酶活测定71-72
• 4.4.7 重组菌上罐发酵72-74
• 4.5 本章小结74-76
• 第五章 总结与建议76-80
• 5.1 结论76-77
• 5.2 创新点77
• 5.3 问题与建议77-80
• 参考文献80-86
• 附录1. 本研究用到的试剂86-88
• 附录2 本研究所用到的仪器88-90
• 附录3 本研究所用到的引物90-92
• 致谢92-94
• 攻读学位期间发表的学术论文目录94-96
• 作者和导师简介96-97
• 附件97-98

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 张鸿达;刘成;高卫华;邹少兰;张敏华;;微生物发酵法生产3 羟基丙酸的研究进展[J];化工进展;2007年01期

2 张智清,姚立红,侯云德;含P_RP_L启动子的原核高效表达载体的组建及其应用[J];病毒学报;1990年02期

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本文编号：987188