Prx Ⅲ在大鼠肾缺血再灌注损伤模型心肌内的表达变化

发布时间：2017-10-07 23:33

  本文关键词：Prx Ⅲ在大鼠肾缺血再灌注损伤模型心肌内的表达变化

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【摘要】：肾脏是机体内重要的排泄与分泌器官,对维持机体酸碱平衡以及钾、钠、钙等电解质的稳定具有重要作用。因此,肾脏对维持机体整个内环境的平衡稳定具有重要意义。研究发现:当肾脏功能被损害时,其远端或邻近器官如肝、肺、心、脑和肠等的功能也会同时受损[1]。肾缺血再灌注损伤(Renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是临床上一种常见的病理生理反应,常见于肾脏移植或急性肾动脉阻断等临床治疗过程中。RIRI也是导致肾移植病人术后功能恢复延迟,甚至发生急性肾衰增加患者死亡率的重要因素。在到达肾脏的血流被暂时性阻断,随后又恢复其血液供应重新充氧的过程中,会有大量的活性氧族(reac-tive oxygen species,ROS)产生,导致肾脏处于高度氧化应激状态。这也是引发缺血再灌注损伤的重要机制之一。ROS的成员主要包括超氧阴离子(O~(2-))、羟自由基(OH-)和过氧化氢(H_2O_2)等。ROS的化学性质非常活泼,可以与细胞内的功能蛋白质、DNA和胞膜上的脂类等生物大分子发生过氧化反应,促进细胞凋亡和死亡,加剧肾脏组织损伤。Peroxiredoxin(Prx)是近几年发现的一类能清除ROS的过氧化物酶系。Prx Ⅲ是Prx家族成员之一,也是整个家族中唯一的特异性定位于线粒体的酶蛋白。研究发现:Prx Ⅲ产生于细胞内质网,然后依靠定位信号定位于线粒体。线粒体是细胞内ROS的主要产生来源,同时它自身也是ROS的主要攻击靶点。近些年的研究发现:Prx Ⅲ与细胞线粒体内H_2O_2的清除有密切关系。Prx Ⅲ可能是线粒体内ROS的重要清除者。心脏是机体内需氧量大、对缺血缺氧反应极为敏感的脏器之一。线粒体氧化磷酸化产生的ATP是心肌细胞的主要能量来源。在此过程中会有大量电子从呼吸链泄露出来从而形成ROS。因此,心脏是机体内最容易受到ROS攻击遭受过氧化损伤的器官。在肾缺血再灌注损伤发生后,肾脏处于高度氧化应激状态时,心脏此时是否也会发生过氧化损伤,氧化应激是否也是引起心肌损伤的主要机制之一?心肌组织Prx Ⅲ的表达如何变化,是否参与此氧化应激过程?未见报道。本研究采用无损伤动脉夹钳夹肾动脉法建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型。再灌注24小时后观察心肌组织内H_2O_2含量、MDA含量,以及抗氧化酶Prx Ⅲ基因水平和蛋白水平的表达变化,探讨肾脏缺血再灌注损伤诱发心肌组织损伤的氧化应激机制,以及Prx Ⅲ在缺血再灌注损伤过程中的抗氧化作用,为防治肾缺血再灌注引起的心肌组织损伤提供一条新思路。目的:观察大鼠肾脏缺血再灌注损伤发生后心肌组织是否也处于氧化应激状态,以及抗氧化酶Prx Ⅲ的基因水平和蛋白水平的表达变化,探讨肾脏缺血再灌注损伤诱发心肌损伤的氧化应激机制,以及Prx Ⅲ在此过程中可能发挥的抗氧化作用。方法:1肾脏缺血再灌注损伤模型的制备及取材雄性Wister大鼠12只,体重200±10g,购于河北医科大学实验动物中心,随机分为对照组(Control)和肾脏缺血再灌注损伤组(RIRI),每组各6只。用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg),参照余晓东等人的方法制备肾脏缺血再灌注损伤模型。RIRI组大鼠开腹后暴露其双侧肾脏,先切除右肾,然后钝性分离左肾动脉,在靠近肾门处用无创动脉夹夹闭左肾动脉,观察肾脏由鲜红色逐渐变为暗红色。45 mins后松开动脉夹,恢复血液供应,肉眼可见肾动脉充盈,肾脏由暗红色迅速变为鲜红色,表明再灌注成功。对照组大鼠开腹后只切除右肾,分离左肾动脉,但不夹闭左肾动脉。24小时后收集血液,3000rpm离心10min,分离血清用于肌酐(Serum Creatinine,SCr)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)浓度测定;处死大鼠取肾脏和心脏,将肾脏于4%多聚甲醛中固定进行HE染色,观察肾脏的形态学改变。将心脏置于液氮中用于Prx Ⅲ m RNA和蛋白水平测定以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)和H_2O_2含量测定。2测定指标及方法2.1血清SCr和BUN水平测定血清SCr浓度采用苦味酸法测定;血清BUN浓度采用酶偶联速率法测定。2.2 HE染色观察大鼠肾脏的形态结构肾脏组织经常规脱水、透明,石蜡包埋后,切片厚约5μm,苏木精伊红染色,日本产Olympus光学显微镜下观察肾脏的形态变化并进行图象分析。2.3大鼠心肌组织MDA含量测定将从-70℃冰箱中取出的心肌组织按照10mg/100μl加入预冷的匀浆缓冲液(50mmol/L磷酸钾缓冲液,PH7.4,1mmol/L盐酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巯基乙醇),冰浴中匀浆,匀浆液4000rpm 4℃离心20min,取上清即制成10%心肌组织匀浆,匀浆内MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)测定试剂盒测定。2.4大鼠心肌组织H_2O_2含量测定将从-70℃冰箱中取出的心肌组织按照10mg/100μl加入预冷的匀浆缓冲液(50mmol/L磷酸钾缓冲液,PH7.4,1mmol/L盐酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巯基乙醇),冰浴中匀浆,匀浆液4000rpm 4℃离心20min,取上清即制成10%心肌组织匀浆。匀浆内H_2O_2含量采用钼酸比色法测定,以每克样本蛋白所含的过氧化氢的量(mmol/g pro)表示。2.5大鼠心肌组织Prx Ⅲ m RNA水平测定用TRIzol法提取心肌总RNA。约3μg总RNA反转录成c DNA。以GAPDH为内对照,进行RT-PCR。分别以Prx Ⅲ的扩增产物与GAPDH灰度值之比表示目的基因的相对表达量2.6大鼠心肌组织Prx Ⅲ蛋白水平测定采用Western blot法测定大鼠心肌组织内抗氧化酶Prx Ⅲ的蛋白表达水平。将大鼠心肌组织制成匀浆,离心后取上清。采用改良Lowry法测定其蛋白总量.电泳的蛋白上样量为62 ug.经过转膜及封闭处理后,在PVDF膜上加入兔抗Prx Ⅲ抗体,室温静置过夜。经洗膜后再加入荧光标记的抗兔Ig G二抗。经双色红外线成像系统扫描照相并进行图像数值分析。结果:1大鼠肾组织的形态学改变光学显微镜下可见正常组大鼠肾血管球、肾小囊、近曲、远曲小管及集合管形态结构清晰规整。而RIRI组大鼠可见部分肾小球萎缩,体积变小;肾小囊腔扩张;肾小管管腔明显扩张;肾间质水肿,肾小管间隙扩大;集合管出现管腔扩张等改变。2血清SCr水平Con组大鼠血清中SCr的浓度为103.444±8.465μmol/L,而RIRI组血清SCr的浓度为131.153±17.814μmol/L。RIRI组大鼠血清SCr浓度明显高于Con组(P0.05)。3血清BUN水平Con组大鼠血清BUN的浓度为4.462±0.541 mmol/L,而RIRI组血清BUN的浓度为13.685±4.397 mmol/L。RIRI组大鼠血清BUN的浓度明显高于Con组(P0.05)。4心肌组织匀浆内MDA的含量Con组大鼠心肌组织匀浆内的MDA含量为10.18±1.77mmol/g,而RIRI组心肌组织匀浆内的MDA含量为14.01±2.29 mmol/g。RIRI组大鼠心肌组织匀浆内的MDA含量明显高于Con组(P0.01)。5大鼠心肌组织匀浆内H_2O_2的含量Con组大鼠心肌组织匀浆内的H_2O_2含量为13.93±1.88 mmol/g,而RIRI组心肌组织匀浆内的H_2O_2含量为18.56±2.56 mmol/g。RIRI组大鼠心肌组织匀浆内的H_2O_2含量明显高于Con组(P0.01)。6大鼠心肌组织Prx Ⅲ m RNA的相对表达量采用RT-PCR的方法测定大鼠心肌组织内Prx Ⅲ m RNA的相对表达量。Con组大鼠心肌组织内Prx Ⅲ m RNA的相对表达量为0.95±0.17,RIRI组心肌组织内Prx Ⅲ m RNA的相对表达量为1.34±0.18,RIRI组大鼠心肌组织内Prx Ⅲ m RNA水平明显高于Con组(P0.01)。说明RIRI组大鼠心肌组织内Prx Ⅲ的基因表达水平升高。7大鼠心肌组织Prx Ⅲ蛋白水平Con组大鼠心肌组织内Prx Ⅲ的蛋白表达水平为0.58±0.09,RIRI组大鼠心肌组织内Prx Ⅲ的蛋白表达水平为1.01±0.17。RIRI组Prx Ⅲ蛋白水平明显高于对照组(P0.01)。说明RIRI组大鼠心肌组织内Prx Ⅲ的蛋白表达水平升高。结论:1切除右肾后在靠近肾门处用无创动脉夹夹闭左肾动脉可成功建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型。2肾脏缺血再灌注损伤发生后,心肌组织也处于高度氧化应激状态,并引起心肌组织的过氧化损伤。3 Prx Ⅲ的基因和蛋白表达水平在RIRI模型心肌组织内均明显增强。表明Prx Ⅲ可能参与了RIRI所诱发的心肌组织氧化应激反应,在心肌组织内发挥了抗氧化作用。
【关键词】：肾缺血再灌注损伤 氧化应激 Prx Ⅲ MDA H_2O_2
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692;R-332
【目录】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-15
• 前言15-17
• 材料与方法17-26
• 结果26-28
• 附图28-34
• 附表34-36
• 讨论36-38
• 结论38-39
• 参考文献39-41
• 综述 肾缺血再灌注损伤的病理生理学表达变化41-54
• 参考文献48-54
• 致谢54-55
• 个人简历55

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