钙依赖性蛋白激酶CDPK3和CDPK5作为隐孢子虫病潜在药物靶标的研究
发布时间：2021-01-09 12:31
隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）及毕氏肠微孢子虫（Enterocytozoon bieneusi）是两种新发传染病病原,导致人和动物腹泻、体重减轻和生长迟缓,对人类健康以及畜牧业带来严重危害。在隐孢子虫中,微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）可以感染多种动物,具有较为广泛的宿主范围,因此具有人兽共患意义。目前,隐孢子虫病仍然缺乏有效的治疗药物,药物筛选工作亟待开展。钙依赖性蛋白激酶（calcium-dependentprotein kinase,CDPKs）广泛存在于包括隐孢子虫在内的顶复门原虫中,但尚未在人和动物中发现,因此被认为是潜在的药物靶标。目前,针对于隐孢子虫CDPKs（CpCDPKs）功能的研究多集中于对CpCDPK1的研究与抑制剂设计,而对于CpCDPK家族其它蛋白的研究仍非常匮乏。本研究中,原核表达了隐孢子虫的钙依赖性蛋白激酶家族的两个成员,CpCDPK3及CpCDPK5,并对二者进行了初步功能探究,对相应的抑制剂进行了筛选,评估了二者作为药物靶标的可行性。通过大肠杆菌克隆并原核表达了重组CpCDPK3蛋白,初步测定了其酶活性...
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：140 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．１隐孢子虫生活史阶段—??Ｆｉｇ．?１．１?Ｌｉｆｅ?ｃｙｃｌｅ?ｓｔａｇｅｓ?ｏｆ?Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ＾??
华东理工大学博士学位论文?第５页??骛：？⑩??雀丄??食源八源性??图１．２隐孢子虫的传播途径??Ｆｉｇ．?１．２?Ｔｈｅ?ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ?ｏｆ?Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ??１．３隐孢子虫病的危害与防控??隐孢子虫是一种寄生性顶复门原虫，可以感染包括人类在内的大多数脊椎动物，引??起隐孢子虫玻隐孢子虫病是被世界卫生组织（ＷＨＯ）认定的人类常见六大腹泻病因之??一。一般情况下，隐孢子虫病的临床症状会在被感染一周后开始出现，症状主要表现为??腹泻，但是对于不同免疫能力的患者，其临床症状的严重程度具有差异。通常，隐孢子??虫病的症状在免疫力正常人群中表现为自限性腹泻，持续５－１０天，可能伴有发热、腹??痛、恶心或肠胃炎等症状１３８１。部分患者会出现症状反复的现象，一般是指在第一次腹泻??结束几周后，再次出现腹泻症状［３９，４（）１。在儿童或免疫力低下人群中，隐孢子虫病的症状??更为严重，其主要表现为急性腹泻，约有半数患者会有超过１４天的持续腹泻症状，导??致体重减轻，严重时可能会危及生命｜４Ｍ２］。若患者不足一岁，则隐孢子虫病可能导致儿??童营养不良和发育迟缓。对于免疫缺陷人群（艾滋病人等），隐孢子虫病的症状会变得更??为多变且严重，其持续性的霍乱样腹泻会引起宿主的严重脱水，导致死亡［２２１。对于感染??隐孢子虫病的艾滋病人，隐孢子虫还会感染部分患者的胆道和呼吸道，引起并发症，最??终导致死亡［４３】。??目前，隐孢子虫病药物的筛选工作仍在进行中｜４４￣＾，已有部分药物初步用于治疗，??但是在临床试验中显示的效果较差［４７，４８】。硝唑尼特（Ｎｉｔａｚｏｘａｎｉｄｅ，ＮＴＺ）是目前美国食??品药
华东理工大学博士学位论文?第７页??／?？镳??＾Ｋ，?＾３ｋ?＾?ｍ?．?／Ｉ??图１．３改良抗酸染色后的隐孢子虫卵囊??（图片来源：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｄｐｄｘ／ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄ丨ｏｓｉｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍＬ）??Ｆｉｇ．?１．３?Ｃｔｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ?ｓｐ．?ｏｏｃｙｓｔｓ?ｓｔａｉｎｅｄ?ｗｉｔｈ?ｍｏｄｉｆｉｅｄ?ａｃｉｄ－ｆａｓｔ?ｓｔａｉｎｓ??■??图１．４免疫荧光染色的隐孢子虫卵囊??Ｆｉｇ．?１．４?Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ?ｓｐ．?ｏｏｃｙｓｔｓ?ｕｎｄｅｒ?ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ??１．４．２分子生物学鉴定??近年来，由于分子生物学技术的飞速发展，ＤＮＡ测序越来越被广泛应用于隐孢子??虫鉴定之中。通过ＰＣＲ技术对隐孢子虫ＳＳＵ?ｒＲＮＡ片段进行扩增，然后对扩增产物进??行纯化并进行ＤＮＡ测序，最后将目的序列与基因文库进行比对，即可依据文库中参考??序列判断出样品所属的隐孢子虫虫种或基因型。ＰＣＲ结合测序方法的优点是能够直观地??比较不同虫种／基因型样本间的序列差异，便于精确地进行虫种区分。??目前，在隐孢子虫的基因亚型区分中，使用最为广泛的为ｇｐ６０基因位点，该方法??不仅能够区分Ｃ?ｐｏｒｖｗｗ和Ｃ．?／ｊｏｗ／ｍ＇ｓ虫种，还可以对多种虫种的基因亚型进行区分１１夂??５３，５４］。目前，通过ｇｐ６０基因分型工具，己对的２０种亚型进行了鉴定，在Ｃ??中也鉴别出了?１０个基因亚型［５５－５７］。除结合测序外，基于ＰＣＲ的分型技术也衍??生出了多种隐孢子虫检测手段，例如限制性片段长度多态性分析（ＲＦＬＰ）、多位点分型
【参考文献】：
期刊论文
[1]6500 V SiC场限环终端设计与实现[J]. 杨同同,杨晓磊,黄润华,李士颜,刘奥,杨立杰,柏松. 固体电子学研究与进展. 2018(01)
[2]分子对接软件在药物设计中的应用[J]. 赵晨,夏春光,于敏,潘月,王辂. 中国抗生素杂志. 2015(03)
[3]毕氏肠微孢子虫基因分型及公共卫生学重要性[J]. 刁瑞南,肖立华,宋铭忻,李巍. 中国预防兽医学报. 2014(12)
[4]隐孢子虫及其致病研究进展[J]. 乐海华,倪春辉. 江苏预防医学. 2014(05)
[5]青海牦牛隐孢子虫病的血清学调查[J]. 马利青,陆艳,蔡其刚,王戈平,牛小迎,叶成玉,李晓卉. 家畜生态学报. 2011(02)
[6]分子对接方法的应用与发展[J]. 段爱霞,陈晶,刘宏德,刘秀辉,卢小泉. 分析科学学报. 2009(04)
[7]牦牛隐孢子虫感染调查[J]. 周春香,何国声,张龙现. 中国人兽共患病学报. 2009(04)
[8]微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15/60基因的克隆与原核表达[J]. 于慧珠,陈兆国,岳城,米荣升,夏延富. 中国兽医科学. 2008(08)
[9]青海省化隆县牦牛隐孢子虫流行病学调查[J]. 王春景,刘恒明. 中国兽医杂志. 2007(05)
[10]青海省湟源县牦犊牛隐孢子虫病调查[J]. 窦春香. 畜牧与饲料科学. 2007(03)
博士论文
[1]三种人兽共患胃肠道原虫的全基因组测序及比较基因组研究[D]. 刘世友.华东理工大学 2016
本文编号：2966655
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：140 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．１隐孢子虫生活史阶段—??Ｆｉｇ．?１．１?Ｌｉｆｅ?ｃｙｃｌｅ?ｓｔａｇｅｓ?ｏｆ?Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ＾??
华东理工大学博士学位论文?第５页??骛：？⑩??雀丄??食源八源性??图１．２隐孢子虫的传播途径??Ｆｉｇ．?１．２?Ｔｈｅ?ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ?ｏｆ?Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ??１．３隐孢子虫病的危害与防控??隐孢子虫是一种寄生性顶复门原虫，可以感染包括人类在内的大多数脊椎动物，引??起隐孢子虫玻隐孢子虫病是被世界卫生组织（ＷＨＯ）认定的人类常见六大腹泻病因之??一。一般情况下，隐孢子虫病的临床症状会在被感染一周后开始出现，症状主要表现为??腹泻，但是对于不同免疫能力的患者，其临床症状的严重程度具有差异。通常，隐孢子??虫病的症状在免疫力正常人群中表现为自限性腹泻，持续５－１０天，可能伴有发热、腹??痛、恶心或肠胃炎等症状１３８１。部分患者会出现症状反复的现象，一般是指在第一次腹泻??结束几周后，再次出现腹泻症状［３９，４（）１。在儿童或免疫力低下人群中，隐孢子虫病的症状??更为严重，其主要表现为急性腹泻，约有半数患者会有超过１４天的持续腹泻症状，导??致体重减轻，严重时可能会危及生命｜４Ｍ２］。若患者不足一岁，则隐孢子虫病可能导致儿??童营养不良和发育迟缓。对于免疫缺陷人群（艾滋病人等），隐孢子虫病的症状会变得更??为多变且严重，其持续性的霍乱样腹泻会引起宿主的严重脱水，导致死亡［２２１。对于感染??隐孢子虫病的艾滋病人，隐孢子虫还会感染部分患者的胆道和呼吸道，引起并发症，最??终导致死亡［４３】。??目前，隐孢子虫病药物的筛选工作仍在进行中｜４４￣＾，已有部分药物初步用于治疗，??但是在临床试验中显示的效果较差［４７，４８】。硝唑尼特（Ｎｉｔａｚｏｘａｎｉｄｅ，ＮＴＺ）是目前美国食??品药
华东理工大学博士学位论文?第７页??／?？镳??＾Ｋ，?＾３ｋ?＾?ｍ?．?／Ｉ??图１．３改良抗酸染色后的隐孢子虫卵囊??（图片来源：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｄｐｄｘ／ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄ丨ｏｓｉｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍＬ）??Ｆｉｇ．?１．３?Ｃｔｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ?ｓｐ．?ｏｏｃｙｓｔｓ?ｓｔａｉｎｅｄ?ｗｉｔｈ?ｍｏｄｉｆｉｅｄ?ａｃｉｄ－ｆａｓｔ?ｓｔａｉｎｓ??■??图１．４免疫荧光染色的隐孢子虫卵囊??Ｆｉｇ．?１．４?Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ?ｓｐ．?ｏｏｃｙｓｔｓ?ｕｎｄｅｒ?ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ??１．４．２分子生物学鉴定??近年来，由于分子生物学技术的飞速发展，ＤＮＡ测序越来越被广泛应用于隐孢子??虫鉴定之中。通过ＰＣＲ技术对隐孢子虫ＳＳＵ?ｒＲＮＡ片段进行扩增，然后对扩增产物进??行纯化并进行ＤＮＡ测序，最后将目的序列与基因文库进行比对，即可依据文库中参考??序列判断出样品所属的隐孢子虫虫种或基因型。ＰＣＲ结合测序方法的优点是能够直观地??比较不同虫种／基因型样本间的序列差异，便于精确地进行虫种区分。??目前，在隐孢子虫的基因亚型区分中，使用最为广泛的为ｇｐ６０基因位点，该方法??不仅能够区分Ｃ?ｐｏｒｖｗｗ和Ｃ．?／ｊｏｗ／ｍ＇ｓ虫种，还可以对多种虫种的基因亚型进行区分１１夂??５３，５４］。目前，通过ｇｐ６０基因分型工具，己对的２０种亚型进行了鉴定，在Ｃ??中也鉴别出了?１０个基因亚型［５５－５７］。除结合测序外，基于ＰＣＲ的分型技术也衍??生出了多种隐孢子虫检测手段，例如限制性片段长度多态性分析（ＲＦＬＰ）、多位点分型
【参考文献】：
期刊论文
[1]6500 V SiC场限环终端设计与实现[J]. 杨同同,杨晓磊,黄润华,李士颜,刘奥,杨立杰,柏松. 固体电子学研究与进展. 2018(01)
[2]分子对接软件在药物设计中的应用[J]. 赵晨,夏春光,于敏,潘月,王辂. 中国抗生素杂志. 2015(03)
[3]毕氏肠微孢子虫基因分型及公共卫生学重要性[J]. 刁瑞南,肖立华,宋铭忻,李巍. 中国预防兽医学报. 2014(12)
[4]隐孢子虫及其致病研究进展[J]. 乐海华,倪春辉. 江苏预防医学. 2014(05)
[5]青海牦牛隐孢子虫病的血清学调查[J]. 马利青,陆艳,蔡其刚,王戈平,牛小迎,叶成玉,李晓卉. 家畜生态学报. 2011(02)
[6]分子对接方法的应用与发展[J]. 段爱霞,陈晶,刘宏德,刘秀辉,卢小泉. 分析科学学报. 2009(04)
[7]牦牛隐孢子虫感染调查[J]. 周春香,何国声,张龙现. 中国人兽共患病学报. 2009(04)
[8]微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15/60基因的克隆与原核表达[J]. 于慧珠,陈兆国,岳城,米荣升,夏延富. 中国兽医科学. 2008(08)
[9]青海省化隆县牦牛隐孢子虫流行病学调查[J]. 王春景,刘恒明. 中国兽医杂志. 2007(05)
[10]青海省湟源县牦犊牛隐孢子虫病调查[J]. 窦春香. 畜牧与饲料科学. 2007(03)
博士论文
[1]三种人兽共患胃肠道原虫的全基因组测序及比较基因组研究[D]. 刘世友.华东理工大学 2016
本文编号：2966655
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