检测柯萨奇病毒A10的RT-PCR方法研究及白叶藤碱类似物的合成与抗菌、抗病毒活性评价

发布时间：2020-11-19 13:00

　　 第一部分:手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)是在世界范围内流行的儿童常见传染病。临床上主要症状以发热和手、足、口腔等部位皮疹或疱疹为主要表现。在少数病例中,患者也会出现神经并发症,像脑脊髓炎和无菌性脑膜炎。在亚太地区,已报道有多次手足口病的大流行,尤其是在整个南亚地区。而引发HFMD的肠道病毒现在主要为肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CVA16)。其他肠道病毒如CVA4、CVA6、CVA10等也是该病的病原体。近年来越来越多的证据表明,在这些病原体中,柯萨奇病毒A10相关的HFMD发病率呈上升的趋势。CVA10病毒最早在1957年一位新西兰的手足口病患者身上被分离出来,日本最早报道发生流行是在1983年。2008年的时候新加坡手足口病大流行,约11.8%的患者被检测出来是由CVA10病毒感染引起的;同年在欧洲芬兰的手足口病大流行,也认为CVA10是导致疾病发生的主要病原体。通过哨点检测数据发现,2010年手足口病的发病中CVA10感染率占到了39.9%,高于EV71和CVA16的感染率。在我国大陆地区,用CVA10作为手足口病的感染病原体的检测指标,已经和EV71、CVA16的地位相当。尤其是近年来,在整个手足口病的暴发流行检测中,除了EV71和CVA16,CVA10也“功不可没”。因此,研究CVA10病毒的基因变异和演化非常重要,尤其在发生手足口爆发流行的时候。同时,针对于该型病毒建立一个快速诊断的方法也具有重要的意义,特别是针对病毒感染的检测和病毒流行的监控方面。本部分的研究工作主要有以下几个方面的内容:1.快速检测柯萨奇A10病毒的实时RT-PCR方法在本部分研究中,我们分析了VP1基因的保守区域,构建了在我国大陆地区流行的CVA10病毒的VP1基因探针。开发一种快速检测CVA10病毒的Taq Man实时荧光定量RT-PCR检测技术,同目前使用的HEV通用引物的常规检测相比该方法更加灵敏、准确,同时该方法是一种定量的检测方法,对CVA10病毒的的检测限可以达到10 copies/μl。而此前尚未有VP1基因所构建的快速检测CVA10病毒的实时荧光定量RT-PCR的相关研究结果报道。2.“三步法”扩增CVA10全基因组本研究基于CVA10全基因组序列设计了一个长片段的“三步法”扩增CVA10全基因组RT-PCR方法。在实验过程中设计了A105UF/A820,EVP4/A6141和A4879/A1005R三对引物用于CVA10全长基因组扩增。结果显示这个方法能准确地扩增CVA10毒株的三个重叠的基因,获得全基因组序列,结果稳定可重复。与之前发表的“六步法”RT-PCR方法相比,这一方法快速准确,而且能够用于扩增从我国大陆地区分离的CVA10毒株的全基因组。第二部分从天然产物中寻找有效的活性成份并对其进行进一步的结构修饰是人们寻找新药的重要途径之一。白叶藤碱是一类吲哚并喹啉类的生物碱,最早是从西非的一种用于治疗疟疾的攀爬类灌木植物Cryptolepis sanguinolenta中分离出来的。近年来研究表明这类吲哚并喹啉类化合物具有广泛的生理学活性,包括抗菌、抗毒覃碱、解热抗炎、抗锥形虫、抗疟疾等药理作用。在本部分的研究中,我们首次报道了8个新合成的双取代白叶藤碱衍生物,并选择了部分革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌和柯萨奇病毒A10作为试验研究对象,评价了这些新合成化合物的抗菌、抗病毒活性。本部分研究结果显示,该类化合物具有广谱的抗菌作用,对于病毒增殖也具有明显的抑制作用。抗菌方面:化合物6d和6h呈现出的抗菌活性最强。最小抑菌浓度分析显示化合物6d对真菌和所测试的革兰阳性菌(肺炎链球菌,枯草芽孢杆菌)的抗菌作用优于广谱抗真菌药物两性霉素B和氨苄西林,而对革兰阴性菌(大肠埃希菌)的抗菌作用则与氨苄西林相当。上述结果提示该类化合物具有成为抗菌药物先导化合物的条件。抗病毒方面:化合物对CVA10表现出良好的抗病毒活性。构效关系分析显示,在白叶藤碱7、8和9,11-位引入两条侧链后,化合物6a-6h抗病毒活性均下降,但没有一定的规律。而7、8和9位分别是甲氧基取代时活性较好,其中9位甲氧基取代(3c)抗病毒活性最好,选择指数也最高。由于化合物数量较少,该数据不能够完全讨论出化合物的构效关系,但从结果我们可以看出,长的侧链的引入降低了化合物的细胞毒性的同时,也降低化合物的抗病毒活性;而短取代基甲氧基的引入则是提高化合物的抗病毒活性,但是相应的细胞毒性也比较强。这些结果对于我们后续进行白叶藤碱结构的改造具有重要的指导意义。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R512.5;R440
【部分图文】：

图 1 柯萨奇病毒是单股的正链小 RNA 病毒，病毒颗粒呈球形，为立体对称的二十面体，5’端共价结合了大小约为 7kDa 小分子蛋白质 Vpg，该蛋白与基因组装配以及病毒 RNA 合成有关；3’端带有 polyA 尾。Fig.1 Coxsackievirus structure ， Coxsackievirus is a 7.2-kb single-strands ，positive-sense RNA virus with a single open reading frame joined to a 5’untranslatedregion and a short viral priming protein（VPg）表 1 人类肠道病毒的传统分类和型别Table 1 Traditional classification and gene classification of human enterovirus

12图 2 儿童手足口病的典型临床症状[8]Fig.2 Manifestations of typical HFMD1.3 柯萨奇病毒流行病学情况在既往的主要的研究中，人们发现 EV71 与 CVA16 是导致手足口病的主要病原体。最新的研究发现，其他一些型别的柯萨奇病毒也能能导致手足口病。自安徽省阜阳等地区于 2008 年 4 月出现以 EV71 型感染引起的手足口病流行暴发以来，近几年来手足口病的发病数和发病率在整个安徽省都呈现逐年升高的趋势。

2009-2011年中国手足口病患者肠道病毒的分型[14]
【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 蒋秀群;;手足口病临床观察与治疗分析[J];中国当代医药;2011年32期

2 赵成松;赵顺英;;手足口病的流行概况和应对策略[J];中国实用儿科杂志;2009年06期

3 廖承琳;潘家华;吕勇;徐友和;李晓红;倪陈;;小儿手足口病289例临床观察及治疗策略[J];安徽医学;2008年04期

本文编号：2890042