经LV-mmp13转染的巨噬细胞逆转日本血吸虫病肝纤维化的研究

发布时间：2020-11-20 01:38

　　 背景我们以前的研究表明,Ⅱ型弓形虫的致密颗粒蛋白15(dense granule protein15_Ⅱ,GRA15_Ⅱ)可诱导巨噬细胞向M1极化;构建的gra15_Ⅱ慢病毒(lentivirus-gra15_Ⅱ,LV-gra15_Ⅱ)能转化巨噬细胞为M1(LV-gra15_Ⅱ-M1)而使后者发挥有效的预防日本血吸虫病肝纤维化的作用。其中,LV-gra15_Ⅱ-M1分泌的基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)在溶解胶原纤维中起到重要的作用。本研究中,我们构建mmp13慢病毒,并体外转染巨噬细胞。将该巨噬细胞(LV-mmp13-M)输注入日本血吸虫病小鼠体内,了解其对日本血吸虫病肝纤维化的治疗作用和机制。方法首先构建LV-mmp13和LV-gra15_Ⅱ,然后将其转入巨噬细胞株RAW264.7中,并筛选出稳定的LV-gra15_Ⅱ-M、LV-mmp13-M。用流式测定Ly6C以了解Ly6C表达情况。血吸虫尾蚴感染雌性Balb/c小鼠6周后,将小鼠随机分为四组:PBS、LV-blank-M、LV-gra15_Ⅱ-M和LV-mmp13-M组,并分别通过尾静脉高压注射相应的细胞和PBS。在感染后第8周无痛麻醉处死所有小鼠。取血清检测谷丙转氨酶(glutamic-pyruvictransaminase,ALT)、用ELISA检测HA含量,取肝脏组织分别做羟脯胺酸(HYP)含量检测、HE和Masson染色,并用qRT-PCR、Western-blotting及免疫组化测定MMP13、iNOS、Arg-1、CCL2、α-SMA、ColⅠ。在体外实验中,分别将RAW264.7、LV-blank-M、LV-gra15_Ⅱ-M和LV-mmp13-M与小鼠成纤维细胞株JS1共培养,ELISA方法检测培养液中ColⅠ、MMP13和CCL2含量,流式检测JS1凋亡。结果成功构建了稳定表达的LV-mmp13-M和LV-gra15_Ⅱ-M,其中,LV-gra15_Ⅱ-M具有M1表型。LV-mmp13-M表现为Ly6C低表达而LV-gra15_Ⅱ-M为高表达。在LV-mmp13-M组中,血HA、肝HYP、ColⅠ、肝虫卵肉芽肿和纤维化程度均明显改善,说明LV-mmp13-M能有效逆转肝纤维化。进一步的研究表明,LV-mmp13-M顺利进入肝组织中,并分泌大量的MMP13蛋白,后者促进了胶原蛋白溶解。此外,LV-mmp13-M分泌的CCL2及其他细胞因子在诱导肝成纤维细胞的凋亡,抑制肝纤维化方面也起到了一定的作用。本研究也表明,LV-gra15_Ⅱ-M没有明显的治疗肝纤维化的作用。结论LV-mmp-13-M通过分泌MMP13、CCL2及其他细胞因子溶解胶原纤维并促使肝成纤维细胞的凋亡而发挥逆转日本血吸虫病肝纤维化的作用。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R532.21;R575.2
【部分图文】：

图 1：LV-mmp13-M 与 JS1 共培养结果首先我们依据小鼠的基因库合成 mmp13，再根据弓形虫的基因库构建 gra15Ⅱ，然后分别将这两段基因用慢病毒包装成 LV-mmp13 和 LV-gra15Ⅱ，再分别将它们转染到巨噬细胞株 RAW264.7，并经体外培养、抗性筛选和荧光显微镜检测获得稳定、高转染率的 LV-gra15Ⅱ-M 和 LV-mmp13-M 细胞系。在小鼠感染尾蚴第六周时通过尾静脉高压注射上述相应的细胞，在感染后第 8 周无痛处死所有小鼠。取血清用ELISA 检测透明质酸（HA）含量，取肝脏组织分别做羟脯胺酸（HYP）含量检测、H＆E 和 Masson 染色，并用 qRT-PCR、及免疫组化测定 MMP13、iNOS、Arg-1、CCL2、α-SMA、ColⅠ。在体外实验中，如图 1：分别将 RAW264.7、LV-blank-M、LV-gra15Ⅱ-M 和 LV-mmp13-M 与小鼠成纤维细胞株 JS1 共培养，ELISA 方法检测培养液中 ColⅠ、MMP13 和 CCL2 含量,流式检测 JS1 凋亡。

图 11：LV-mmp13-M 治疗肝纤维化机制图本研究表明，如图 2：LV-mmp13-M 通过分泌 MMP13、CCL2 及其他细胞因溶解胶原纤维并促使肝成纤维细胞的凋亡而发挥逆转日本血吸虫病肝纤维化的作用。2 材料与方法2.1 试剂和仪器2.1.1 细胞培养所需要的试剂：高糖及低糖的 DMEM 培养基，胎牛血清 F从蒙特利尔的 Wisent 合肥分公司（Canada）和中国康明分别购入双抗溶液（青霉素、链霉素）、无血清细胞防冻液以及胰酶消化液从碧云天公司（江苏，中国）购入。Transwell 培养板购于合肥鸿

生物公司合成的mmp13基因和被克隆的基因序列比较
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本文编号：2890742