基于还原氧化石墨烯和金属有机骨架纳米复合物的适体传感器用于ESAT-6的超灵敏检测研究

发布时间：2020-11-20 02:12

　　 结核病(tuberculosis)自古以来就是严重威胁人类生命安全的公共卫生难题,其是由致病性的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)侵入机体导致的慢性呼吸道传染性疾病,其已成为传染性疾病中导致患者死亡的头号死因,截止到目前全世界约有三分之一的人口既往或正遭受MTB的侵袭。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)的统计结果显示,2015年全世界范围内新发的结核病患者数量高达1040万例,结核病已导致逾140万人死亡。随着不规范治疗导致耐药结核菌株的肆虐、人口流动的加速以及艾滋病并发结核感染患者的增加,结核病疫情又呈现出加剧蔓延趋势。早期、及时、准确地检测MTB是有效控制结核病、减少结核扩散和耐药菌株产生的有效手段。目前临床上常用的MTB检测方法包括结核诊断的“金标准”细菌培养、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等均具有不同程度的缺陷,比如耗时长、稳定性差、假阳性率高、影响因素多、灵敏度和特异性差等。此外,由于我国广泛开展卡介苗(Bacille Calmette-Guerin,BCG)接种,要避开BCG导致的假阳性结果准确检测MTB就更为困难。当MTB感染宿主以后,患者体内首先会出现MTB的特异性抗原,这些抗原不受患者免疫状态的影响,因此检测体液中的MTB抗原对于结核病的早期确诊具有重要的临床意义。6-kDa早期分泌抗原靶标(6-kDa early secretory antigenic target,ESAT-6)是MTB分泌的一种早期分泌蛋白,其只在致病性的分枝杆菌中存在,而在BCG菌株中缺失,是理想的MTB检测生物标志物。适体具有合成简便、成本低廉、性质稳定、易于修饰、适用性广,能与目标配体专一性结合等优点,其与靶标结合的亲合力高于抗体。以特异性适体为识别元件构建的电化学适体传感器兼具适体的高特异性和电化学分析方法响应快速、灵敏度高的特性。为了克服MTB检测方法存在的缺陷,本研究拟以ESAT-6作为检测靶标,以其特异性适体作为识别元件,利用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)功能化还原氧化石墨烯掺杂金属有机骨架(Poly(diallyldimethylammonium chloride)functioned reduced graphene oxide doped with metal-organic framework,P-MOF-rGO)纳米复合物的大比表面积、高导电率和稳定性构建电化学适体传感器用于MTB检测,以实现结核病的早期、准确诊断。本研究的主要内容如下:目的:以P-MOF-rGO纳米杂化物作为电极的固载材料构建label-free型电化学适体传感器用于结核抗原ESAT-6的超灵敏检测,为结核病的早期、准确诊断提供有效平台。方法:制备P-MOF-rGO纳米杂化材料固载到玻碳电极(Glassy carbon electrode,GCE)表面,以甲苯胺蓝(Toluidine Blue,TB)作为电活性物质孵育到电极上,利用铂金核壳(platinum/gold core/shell,Pt@Au)优异的电催化性能进行电信号放大,通过金硫键将巯基化的ESAT-6连接适体(ESAT-6 binding aptamer,EBA)结合到GCE表面,用小牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)封闭多余的活性位点来构建电化学适体传感器,并对TB和Pt@Au的体积进行优化。通过检测适体与不同浓度ESAT-6结合前后电流的变化来确定传感器的灵敏度。以葡萄糖、BSA、抗坏血酸(ascorbic acid,AA)、培养滤液蛋白(10-kDa culture filtrate protein,CFP-10)等内源性分子作为干扰物质考察传感器的特异性。通过采用循环伏安法(Cyclic voltammetry,CV)连续扫描50次电极来考察传感器的稳定性。检测5支相同浓度ESAT-6(1 ng/mL)孵育后的电极来考察传感器的重现性。对血清样本进行检测,以考察传感器的临床适用性。结果:所构建的适体传感器在TB体积为5μL,Pt@Au体积为8μL时具有最佳的检测行为。在1.0×10~-44 ng/mL~2.0×10~2 ng/mL的范围内,ESAT-6浓度与传感器峰值电流呈线性关系,传感器的检测限(limit of detection,LOD)为3.3×10~-55 ng/mL。干扰实验结果表明,该传感器能够特异性识别ESAT-6,对干扰物质响应差。稳定性试验提示稳定性良好,50次连续扫描后,电流响应仅下降约3.5%。重现性试验提示该传感器重现性较好,5支电极检测结果的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为2.9%。适体传感器检测血清样本中ESAT-6的加标回收率为99%~102%,该结果令人满意。结论:所构建的超灵敏检测ESAT-6的电化学适配体传感器制备简便、线性检测范围宽、LOD低、稳定性和重现性好,在实际血清样品中测定ESAT-6具有良好的特异性和满意的的加标回收率,有望为MTB感染的及时准确诊断提供有效的技术平台。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R52;TP212.2;O657.1
【部分图文】：

表明 P-MOF-rGO 纳米复合材料已经成功制备。Pt@Au 纳米颗粒显示出带有毛刺的球形结构并呈均匀分散（图 1D）。图.1 (A) MOF, (B) rGO 纳米片, (C) P-MOF-rGO 纳米复合物的 FESEM 图和(D) Pt@Au 纳米颗粒的 TEM 图

的特征吸收峰与文献报道的一致，表明它 a）显示在 1560 和 1365 cm-1处有两个特C-O 键的不对称以及对称伸缩振动。3460表明 MOF 没有完全干燥。745cm-1处的特动。Fe-O 的特征吸收峰可在 555 cm-1处观察的宽吸收峰（曲线 b），这归因于 H2O 分的强吸收峰对应的是 C = C。1570 cm-1附如曲线 c 所示，在 1690，1530，1410 和化纳米材料的特征吸收峰。位于 1690 cm-1 1410 cm-1处的强吸收峰分别由羧基的不基对苯二甲酸连接体中苯环的 C-H 键的弯据一致，表明该复合纳米材料可以用作适

图. 3 P-MOF-rGO 纳米复合物的 XPS 分析图Fig. 3 XPS analysis of P-MOF-rGO nanohybrid感器的电化学表征过程
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本文编号：2890783