外泌体在狂犬病毒感染MRC-5细胞和Vero细胞过程中的作用及机制研究

发布时间：2022-12-18 03:14

　　狂犬病严重影响公共健康,2015年约17,400人死于狂犬病。近年来,细胞培养技术在狂犬病疫苗和其它病毒疫苗生产中得到了广泛的应用。人二倍体细胞（HDCs）和Vero细胞是目前用于狂犬病疫苗生产的常用细胞株。与神经组织疫苗、禽胚组织疫苗、原代地鼠肾细胞疫苗、及鸡胚细胞疫苗相比,HDC和Vero细胞培养的狂犬病疫苗具有更高的安全性。早在1974年,人们通过复杂的驯化和感染条件优化,建立了基于人二倍体细胞MRC-5细胞的狂犬疫苗生产工艺。由于MRC-5对狂犬病毒（RABV）不敏感、扩增周期长、培养程序复杂,且疫苗产率低等不足导致了MRC-5狂犬疫苗的生产成本高。这限制了该类疫苗在狂犬病高发的发展中国家的推广使用。Vero细胞是一永生化的非洲绿猴肾细胞株,该细胞系缺乏I型干扰素（IFN-I）信号通路,是RABV敏感细胞株。1985年,基于Vero细胞生产的狂犬疫苗首次用于接种。本论文拟通过研究RABV与宿主细胞（MRC-5细胞和Vero细胞）相互作用机制,揭示MRC-5细胞抵抗RABV感染而Vero细胞对RABV感染敏感的详细机制,为基于MRC-5细胞的狂犬疫苗生产提供理论依据和技术参考。外... 

【文章页数】：109 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
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缩略词表
第一章 前言
    1.1 外泌体及其研究进展
        1.1.1 外泌体
        1.1.2 外泌体在病毒感染中的功能及机理研究
        1.1.3 基于外泌体的疾病诊断标志物,药物或生物分子传输载体构建及应用
    1.2 狂犬病毒及基于细胞培养的狂犬疫苗现状
        1.2.1 狂犬病毒
        1.2.2 狂犬疫苗的现状
        1.2.3 IFN与狂犬病毒感染的机制
    1.3 micro RNA在病毒感染过程中的功能及机理
        1.3.1 microRNA生物功能
        1.3.2 microRNA在病毒感染过程中的功能及机理
    1.4 立题依据和创新点
        1.4.1 立题依据
        1.4.2 创新点
第二章 外泌体分离方法的建立
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞和病毒
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 常规试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞培养
        2.2.2 狂犬病毒扩增及滴度的测定
        2.2.3 RABV感染细胞
        2.2.4 OptiPrepTM密度梯度分离纯化RABV感染Vero细胞上清液的外泌体
        2.2.5 超速离心分离纯化RABV感染MRC-5 细胞上清液的外泌体
        2.2.6 乙酰胆碱酯酶(AChE)活力的测定
        2.2.7 狂犬病毒G蛋白酶联免疫吸附(ELISA)
        2.2.8 蛋白免疫印记法(Western Blot)验证外泌体标志性蛋白
        2.2.9 透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)
        2.2.10 统计分析
    2.3 实验结果
        2.3.1 OptiPrep~(TM)密度梯度分离纯化RABV感染Vero细胞上清中的外泌体
        2.3.2 超速离心法分离纯化RABV感染MRC-5 细胞上清液中外泌体
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 外泌体能携带miR-423-5p抑制狂犬病毒在MRC-5细胞中的复制
    3.1 实验材料
        3.1.1 主要仪器
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 引物设计
    3.2 实验方法
        3.2.1 RABV感染MRC-5 细胞
        3.2.2 外泌体的制备与表征
        3.2.3 纳米颗粒追踪分析仪(Nanoparticle tracking analysis,NTA)定量外泌体含量
        3.2.4 DiO染料标记外泌体
        3.2.5 DiO-Exo摄取试验
        3.2.6 细胞和外泌体总RNA提取
        3.2.7 外泌体小RNA(small RNA)二代测序及生物信息学分析
        3.2.8 siRNA、miRNA转染细胞试验
        3.2.9 实时定量PCR(qRT-PCR)检测
        3.2.10 双荧光素报告基因的检测
        3.2.11 免疫荧光共聚焦
        3.2.12 统计分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 RABV对 MRC-5 细胞低敏感性
        3.3.2 RABV感染增加宿主细胞外泌体分泌量
        3.3.3 抑制外泌体释放能促进RABV在 MRC-5 细胞的感染
        3.3.4 RABV感染能够改变外泌体miRNA表达谱
        3.3.5 miR-423-5p靶向SOCS3 基因
        3.3.6 miR-423-5p提高MRC-5 细胞抵抗RABV感染
        3.3.7 外泌体miR-423-5p抑制RABV感染MRC-5 细胞
        3.3.8 miR-423-5p对 IFN-I信号通路的作用
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 外泌体促进狂犬病毒对Vero细胞的感染
    4.1 实验材料
        4.1.1 细胞株和病毒
        4.1.2 主要仪器
        4.1.3 主要试剂
        4.1.4 常规试剂
        4.1.5 引物设计
    4.2 实验方法
        4.2.1 狂犬病毒感染Vero细胞
        4.2.2 超薄细胞切片及TEM观察
        4.2.3 NTA定量外泌体含量
        4.2.4 外泌体的制备及表征和鉴定
        4.2.5 外泌体抑制剂对病毒复制影响试验
        4.2.6 病毒总RNA提取和实时定量PCR
        4.2.7 统计分析
    4.3 实验结果
        4.3.1 TEM观察病毒感染细胞释放外泌体
        4.3.2 病毒感染诱导外泌体释放
        4.3.3 GW4869 抑制外泌体释放,降低病毒感染
        4.3.4 si-Rab27a抑制外泌体释放,降低病毒感染
    4.4 讨论
    4.5 小结
结论
参考文献
作者简介及攻读博士期间发表的文章
致谢



本文编号：3721219