烟曲霉果胶裂解酶A抗体检测方法的建立及应用

发布时间：2017-05-20 21:05

  本文关键词：烟曲霉果胶裂解酶A抗体检测方法的建立及应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来,随着糖皮质激素和化疗药物的广泛应用,实体器官移植、造血干细胞移植等的广泛开展,侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)的发病率显著上升,且死亡率极高。早期诊断对IA的成功治疗至关重要,但是目前的IA诊断方法存在检测周期长、敏感性低等缺点,不能满足临床需要。国内外学者正努力寻找用于IA早期诊断的生物标志物。课题组前期筛选了一批免疫优势抗原,首次发现果胶裂解酶A (pectate lyase A, PlyA)与IA患者血清存在免疫反应,有望作为IA的诊断标志物。研究目的原核表达烟曲霉PlyA蛋白,建立检测人血清中抗PlyA蛋白IgG类抗体的间接ELISA方法,评估其在IA诊断中的潜在价值。研究方法对烟曲霉PlyA的基因序列进行生物信息学分析,选择大肠埃希菌偏爱的密码子,进行基因序列优化。委托生物公司合成编码PlyA的DNA序列,并连接到pET28a表达载体,构建重组表达质粒。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3), IPTG诱导表达PlyA重组蛋白；Western blot分析重组蛋白质与抗His标签蛋白(His-tag)单克隆抗体和侵袭性曲霉病患者血清中相应抗体的反应性。用重组PlyA包被微孔板,建立检测抗PlyA抗体的间接ELISA方法,检测IA病人血清,评估该方法对IA的诊断价值。分析了联合检测抗烟曲霉PlyA、TR和DPPV抗体的诊断效果。研究结果(1)同源性分析显示烟曲霉PlyA与人蛋白质不存在同源性,与其他常见病原菌蛋白质的同源性较低。PlyA基因的密码子优化后,在保持氨基酸序列不变的条件下,DNA序列中有18.84%的核苷酸改变。合成基因并成功构建了重组PlyA表达载体,并诱导表达获得带有His标签的PlyA蛋白。(2) Western blot结果表明烟曲霉PlyA可与抗His标签抗体、IA患者血清发生特异性反应,但与其他侵袭性真菌感染病人(如侵袭性念珠菌病)血清和健康人血清无反应。(3)建立了检测抗烟曲霉PlyA抗体的ELISA方法,批内变异系数(CV)为5.3%,批间CV为10.9%,阻断试验阻断率90%,显示该方法具有良好稳定性和特异性。(4)以该方法检测IA患者血清,选择临界值为0.533时,该方法对IA诊断的敏感性51.5%,特异性94.3%。在非中性粒细胞缺乏的IA患者抗PlyA抗体阳性率高于中性粒细胞缺乏的IA患者。抗PlyA、抗TR和抗DPPV抗体联合检测的阳性率可提高到88.7%。结论本研究成功制备了烟曲霉PlyA的重组蛋白,建立了检测抗PlyA抗体的ELISA法,并证明该方法对IA的早期诊断具有潜在的应用价值。
【关键词】：侵袭性曲霉病 果胶裂解酶A 原核表达 ELISA方法
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.6;R519
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 主要英文缩略词表9-11
• 第一章 引言11-16
• 1.1 侵袭性曲霉病的诊断现状11-14
• 1.1.1 临床常用侵袭性曲霉病的实验室诊断方法11-12
• 1.1.2 新兴的IA诊断方法12-14
• 1.2 本论文研究的意义14-16
• 第二章 烟曲霉果胶裂解酶A的基因合成与原核表达16-30
• 2.1 实验材料16-21
• 2.1.1 质粒与菌株16
• 2.1.2 主要试剂及工具酶16
• 2.1.3 清来源16
• 2.1.4 溶液配制16-21
• 2.1.5 主要仪器21
• 2.2 实验方法21-26
• 2.2.1 烟曲霉PlyA的生物信息学分析21
• 2.2.2 烟曲霉PlyA目的基因的优化与合成21-22
• 2.2.3 表达载体的构建与重组蛋白诱导表达22-24
• 2.2.4 重组PlyA蛋白的纯化24-25
• 2.2.5 重组蛋白纯度鉴定及抗原性分析25-26
• 2.3 实验结果26-29
• 2.3.1 烟曲霉PlyA生物信息学分析结果26
• 2.3.2 烟曲霉PlyA目的基因的优化与合成26-27
• 2.3.3 pET28a(+)/PlyA重组质粒的提取及鉴定27
• 2.3.4 重组蛋白的诱导表达及纯化27-28
• 2.3.5 重组蛋白的抗原性分析28-29
• 2.4 讨论29-30
• 第三章 检测抗烟曲霉果胶裂解酶A抗体的ELISA方法建立30-34
• 3.1 实验材料30
• 3.1.1 主要试剂及仪器30
• 3.1.2 清样本30
• 3.1.3 溶液配置30
• 3.2 实验方法30-31
• 3.2.1 PlyA重组蛋白质的制备30
• 3.2.2 ELISA方法的建立30-31
• 3.2.3 抗PlyA抗体检测间接ELISA法的优化31
• 3.2.4 抗PlyA抗体检测间接ELISA法的方法学考核31
• 3.3 实验结果31-32
• 3.3.1 ELISA反应的最佳反应条件31
• 3.3.2 精密度31-32
• 3.3.3 阻断试验32
• 3.4 讨论32-34
• 第四章 ELISA方法检测抗PlyA抗体对IA诊断价值的评估34-40
• 4.1 实验材料34-35
• 4.1.1 血清标本来源34
• 4.1.2 主要试剂及仪器34-35
• 4.2 实验方法35
• 4.2.1 烟曲霉PlyA、TR和DPPV重组蛋白的制备35
• 4.2.2 人血清抗PlyA抗体的测定35
• 4.2.3 临界值的确定35
• 4.2.4 抗烟曲霉TR、DPPV抗体测定35
• 4.2.5 统计学分析35
• 4.3 实验结果35-38
• 4.3.1 临界值的确定35
• 4.3.2 IA患者血清抗PlyA抗体检测结果与分析35-37
• 4.3.3 三种抗体检测方法的比较和联合诊断的价值37-38
• 4.4 讨论38-40
• 第五章 主要结论及展望40-41
• 5.1 主要结论40
• 5.2 展望40-41
• 参考文献41-45
• 附录45-56
• 附录A 烟曲霉PlyA同源性分析结果45-50
• 附录B 烟曲霉PlyA基因合成图50-53
• 附录C IA患者临床特征及血清抗PlyA、抗TR和抗DPPV检测结果53-56
• 攻读硕士学位期间发表论文及参加学术的会议56-57
• 致谢57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 李芳秋;;重新认识特异性抗体对侵袭性真菌病的诊断价值[J];医学研究生学报;2012年04期

2 ;重症患者侵袭性真菌感染诊断与治疗指南(2007)[J];中华内科杂志;2007年11期

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本文编号：382779