抑癌基因Arid2对HBV病毒复制的调控及分子机制研究

发布时间：2017-05-23 09:29

  本文关键词：抑癌基因Arid2对HBV病毒复制的调控及分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：乙型病毒性肝炎(Hepatitis B virus,HBV)是一种严重危害人类健康和生命的传染性疾病,每年大约有100万人死于HBV相关性疾病。哺乳动物酵母交换型转换/蔗糖不发酵复合物(Yeast mating-type switching/sucrose non-fermenting, SWI/SNF)是一种进化保守的多亚基染色质重塑复合物,其核心亚单位BRG1或BRM具有ATP酶活性。SWI/SNF复合物利用ATP水解所释放的能量动员核小体改变染色质结构从而调控靶基因转录。人类的SWI/SNF复合物分两个亚型BAF(BRG1/hBRM-associated factors)和PBAF (Polybromo-associatedBAF),两者仅有几个组成亚基不同。Arid2基因编码的BAF200是新近发现的SWI/SNF复合物核心亚单位PBAF中的一种特异性亚基。研究表明,病毒复制的过程同样需要核染色质重塑蛋白的参与,而作为PBAF中的一种特异性亚基,Arid2对病毒的复制也具有重要的调控作用,Easley等发现Arid2能够影响人类免疫缺陷病毒长末端重复序列(The human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat,HIV LTR)的转录活性从而调控病毒的复制。但是Arid2对HBV感染细胞中病毒复制的调控作用还未见相关报道,本实验旨在HBV稳定复制的细胞系(HepG2-HBV1.1和HepG2.2.15)中观察Arid2能否调控HBV的复制,并进一步探寻Arid2调控HBV复制的相关分子机制。方法：1)在HBV复制的稳定细胞系中通过Western blot和Southern blot检测Arid2表达水平和HBV复制水平的相关性。2)在HBV稳定复制的肝癌细胞系(HepG2-HBV1.1和HepG2.2.15)中,通过Southern blot、 Western blot、 qRT-PCR和ELISA法观察沉默或过表达Arid2后HBV复制水平的变化。3)通过RT-PCR(?)qRT-PCR筛选沉默或过表达Arid2后可能影响HBV复制的转录因子,并进一步通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)、染色质免疫共沉淀实验(chromatin immunoprecipitation,ChIP)深入研究Arid2调控HBV复制的分子机制。结果：Western blot 和Southern blot结果表明,在HBV稳定复制的肝癌细胞系(HepG2.2.15.HepG2-HBV1.1和HepAD38)中,HBV的复制水平和Arid2基因的表达水平呈正相关。qRT-PCR和Southernblot结果证实：沉默Arid2基因的表达后,细胞内的HBV DNA拷贝量、pgRNA和HBcAg的表达量比对照组明显降低(P0.05);ELISA方法检测到siArid2组细胞上清中HBeAg表达降低(P0.05),但上清中HBsAg的表达量与对照组无明显差异(P0.05)。通过RT-PCR筛选与HBV复制相关的转录因子,我们发现沉默Arid2基因的表达后,细胞转录因子PGC-1α的表达明显下调。ChIP实验进一步表明,转录因子PGC-1α能够与HBV增强子结合,且主要与HBV Enhancer Ⅱ结合为主,沉默Arid2后转录因子P GC-1α与HBV增强子的结合水平明显下降。Co-IP实验表明,Arid2蛋白不能与转录因子PGC-1α直接结合。反之,在过表达Arid2的细胞模型中,实验组细胞内的HBV DNA拷贝量、pgRNA和HBcAg的表达量与细胞上清中的]HBeAg表达量比对照组明显增加,同时,细胞内转录因子PGC-1α的表达量也明显增加。ChIP实验证实过表达Arid2后PGC-1α与HBV增强子的结合水平明显增加。结论：在HBV复制状态下,Arid2的表达水平与HBV复制水平呈正相关。Arid2主要通过调控PGC-1 α的表达,并增强PGC-1α与HBV转录调控核心启动子区E nhancer Ⅱ的结合来调控HBV的复制与转录。
【关键词】：HBV Arid2 HBV复制 转录因子 PGC-1α
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一部分 Arid2调控HBV转录与复制的体外实验14-29
• 1 材料与方法14-17
• 2 结果17-26
• 3 讨论26-29
• 第二部分 Arid2促进HBV复制的机制研究29-40
• 1 材料与方法29-32
• 2 结果32-38
• 3 讨论38-40
• 参考文献40-43
• 全文总结43-45
• 文献综述45-53
• 参考文献50-53
• 致谢53-54
• 攻读学位期间发表的学术论文54

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