shRNA沉默Caveolin-1基因对HIV-1TAT诱导的血脑屏障破坏和Aβ的转运蛋白的作用机制

发布时间：2024-06-02 16:30

　　目的:Caveolin-1 shRNA(Cav-1 shRNA)慢病毒载体构建,进一步构建稳定低表达Cav-1的单克隆人脑微血管内皮细胞株,实时荧光定量PCR筛选抑制率最好的单克隆人脑微血管内皮细胞株。方法:(1)筛选出人Cav-1基因干扰序列。制备双链DNA oligo,利用基因重组技术克隆慢病毒表达载体pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro,提取质粒并双酶切后行DNA测序鉴定慢病毒载体。将慢病毒包装辅助质粒和制作的含Cav-1-shRNA的慢病毒载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并用孔稀释法测定病毒滴度。另外,利用上海汉恒生物科技有限公司的阴性序列病毒作为阴性对照。(2)将病毒感染人脑微血管内皮细胞株,挑取2组GFP强表达的细胞克隆团转移种植,建立稳定单克隆细胞株,荧光定量PCR检测Cav-1抑制率,选取抑制率最好的克隆组。结果:经测序鉴定成功构建了慢病毒载体Cav-1 shRNA;利用293T细胞包装重组慢病毒载体后,收集到重组慢病毒颗粒,病毒滴度为:2×10⁸TU/mL;成功扩增获得2株稳定低表达Cav-1的单克隆人脑微血管内皮细胞...

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图1-2重组慢病毒载体测序峰图(部分)

RNA沉默Caveolin-1基因对HIV-1TAT诱导的血脑屏障破坏和Aβ的转运蛋白的作用机制硕士学位论文GGACATC1-1重组慢病毒载体测序结果(黄色部分为插入的shRNA序列)ig.1-1Sequenceresultsoflentivect....

图2重组慢病毒滴度测定结果

8TU/mL。图2重组慢病毒滴度测定结果Fig.2Thevirustiteroflentivetor明视野100X荧光视野100XCtrshRNA-0.1ulCtrshRNA-0.033uLCav-1shRNA-0.1ulCav-1shRNA-0.033ul

图3CCK8法检测细胞活性不同浓度梯度（0,0.5,1,1.5,2,2.5,3μg/mL）Puromycin处理24h对HBEC-5i细胞活性的影响

shRNA沉默Caveolin-1基因对HIV-1TAT诱导的血脑屏障破坏和Aβ的转运蛋白的作用机制硕士学位3.细胞嘌呤霉素（Puromycin）活性筛选实验中的Cav-1shRNA载体含有puro抗性基因，使用Puromycin可以杀死转染的细胞从而筛选稳定转染....

图4-1慢病毒感染人脑血管内皮细胞转染效率评价(72h)

按照人脑血管内皮细胞的MOI值为60，分别在人脑血管内皮细胞中加入CtrshRNA重组慢病毒和Cav-1shRNA重组慢病毒90μL。转染72h后荧光显微镜下观察感染效率>80%(图4-1);然后制作单克隆稳转细胞，从96孔板传代转移到6孔板中的时间周期，人脑血管....

本文编号：3987506