MTB PhoPR双组分系统过表达对MTB致病性的影响及机制研究

发布时间：2017-06-02 04:16

  本文关键词：MTB PhoPR双组分系统过表达对MTB致病性的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨研究结核分枝杆菌Pho PR双组分系统过表达对结核分枝杆菌致病性的影响及其机制。方法:构建及鉴定重组穿梭质粒p MV361-Pho P和p MV361-Pho R,利用电转化技术将重组穿梭质粒分别导入至H37Rv和H37Ra的感受态细胞中构建过表达菌株,并利用实时荧光定量PCR技术进行检测和鉴定,将各过表达各菌株及对照菌株分别感染巨噬细胞,通过CFU菌落计数方法检测各菌株在被感染巨噬细胞内的增殖能力,通过流式细胞技术检测被感染巨噬细胞的凋亡率。结果:1.构建及鉴定了重组穿梭质粒p MV361-Pho P、p MV361-Pho R;2.构建及鉴定了Pho PR双组分系统中Pho P/Pho R基因过表达的H37Rv::Pho P菌株,H37Rv::Pho R菌株,H37Ra::Pho P菌株,H37Ra::Pho R菌株;3.CFU菌落计数检测结果显示:与对照组H37Ra菌株组菌落计数相比较,H37Ra::Pho P菌株组在感染的第0.5天无显著变化,在感染的第1天、第3天菌落数显著增高,差异具有统计学意义(P0.05);H37Ra::Pho R菌株组在感染的第0.5天、第1天、第3天均无显著变化。与对照组H37Rv菌株组菌落计数相比较,H37Rv::Pho P菌株组在感染的第0.5天无显著变化,在感染的第1天、第3天菌落数显著增高,差异具有统计学意义(P0.05);H37Rv::Pho R菌株组在感染的第0.5天、第1天、第3天均无显著变化;4.流式细胞技术检测结果显示:与对照组H37Ra菌株组相比较,H37Ra::Pho P菌株组在感染的1h、12h、24h均无显著变化;在感染的6h有显著增高,差异有统计学意义(P0.05);H37Ra::Pho R菌株组在感染的1h、6h、12h、24h均无显著变化。与对照组H37Rv菌株组相比较,H37Rv::Pho P菌株组在感染的1h、6h、12h、24h均无显著变化;H37Rv::Pho R菌株组在感染的1h、6h、12h、24h均无显著变化。结论:1.成功构建了重组穿梭质粒p MV361-Pho P和p MV361-Pho R;2.成功构建了Pho PR双组分系统中Pho P/Pho R基因过表达的H37Rv::Pho P菌株,H37Rv::Pho R菌株,H37Ra::Pho P菌株,H37Ra::Pho R菌株;3.MTB Pho PR双组分系统中Pho P基因过表达可能使MTB的致病性增强,Pho R基因过表达对MTB的致病性无明显影响。
【关键词】：结核杆菌 过表达 Pho PR双组分系统 增殖 凋亡
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R52
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 英汉缩略语名词对照表9-10
• 前言10-12
• 材料和方法12-26
• 1 材料12-17
• 1.1 菌株12
• 1.2 主要试剂12-14
• 1.3 主要实验仪器设备14-15
• 1.4 主要溶液和培养基15-17
• 1.4.1 主要溶液15-16
• 1.4.2 主要培养基16-17
• 2 实验方法17-26
• 2.1 结核分枝杆菌的培养17
• 2.2 pMV361载体重组质粒的构建17-20
• 2.3 结核分枝杆菌PhoP/PhoR基因过表达菌株的构建20-23
• 2.4 RAW264.7 细胞的培养23-24
• 2.5 结核杆菌感染巨噬细胞模型的建立24
• 2.6 细菌在巨噬细胞内增殖能力的检测（CFU计数）24
• 2.7 Annexin V-FITC/PI技术检测各组感染细胞的凋亡率24-25
• 2.8 统计学分析25-26
• 结果26-35
• 1 菌株的培养26
• 2 MTB Pho P基因、Pho R基因pMV361载体重组质粒的构建26-27
• 2.1 目的基因的PCR扩增26
• 2.2 重组穿梭质粒的鉴定26-27
• 3 MTB Pho P/PhoR基因过表达结核分枝杆菌各毒力菌株的构建27-29
• 3.1 质粒p MV361-PhoP和pMV361-Pho R的提取27
• 3.2 PhoP/Pho R基因过表达菌株抗性筛选27-28
• 3.3 PhoP/Pho R基因过表达菌株质粒的提取与鉴定28
• 3.4 PhoP/Pho R基因的PCR扩增及双酶切鉴定28-29
• 4 实时荧光定量PCR检测29-31
• 4.1 结核分枝杆菌总RNA的提取及鉴定29
• 4.2 各Pho P基因过表达毒力菌株的PhoP基因相对表达量29
• 4.3 各Pho R基因过表达毒力菌株的PhoR基因相对表达量29-30
• 4.4 比较H37Rv、BCG、H37Ra的PhoP/PhoR基因的相对表达量30-31
• 5 CFU菌落计数结果31-32
• 6 各菌株感染巨噬细胞凋亡率检测结果32-35
• 6.1 巨噬细胞凋亡结果32-33
• 6.2 巨噬细胞凋亡结果33-35
• 讨论35-39
• 结论39-40
• 参考文献40-43
• 文献综述43-49
• 参考文献47-49
• 致谢49-50
• 作者简介50-51
• 导师评阅表51

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 张万江;鲍朗;邓喜玲;吴芳;曹旭东;王晓樱;;多耐药临床分离株结核杆菌rpsL基因重组大肠杆菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261/rpsL的构建及其功能鉴定[J];中国病理生理杂志;2006年03期

2 王钊;雷英;吴芳;章乐;曹旭东;吴江东;张辉;张春军;朱彬;邬博;何丽;张玉清;李瑞山;庄睿;梁晨;樊超;李文娟;张万江;;PhoP/PhoR基因过表达结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv的构建及鉴定[J];中国病原生物学杂志;2014年07期

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本文编号：414249