巨片形吸虫病诊断抗原的筛选及相关重组蛋白的诊断价值评价

发布时间：2017-06-05 13:13

  本文关键词：巨片形吸虫病诊断抗原的筛选及相关重组蛋白的诊断价值评价，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的]本研究采用巨片形吸虫病患者血清免疫学筛选巨片形吸虫(Fasciola.gigantica F.g)成虫的cDNA表达文库,寻找巨片形吸虫病血清学诊断的候选抗原,选择巨片形吸虫特异基因进行克隆和表达,并评估重组蛋白的诊断价值。[方法]本文以采集自云南大理农贸市场牛肝胆管内的Eg成虫为材料(通过形态学鉴定及cox1、ITS1-2间隔区和nadl等分子鉴定确认虫种为Eg),提取成虫总RNA,并进一步纯化为mRNA,构建λZAPⅡ cDNA表达文库；用巨片形吸虫病患者混合血清筛选cDNA表达文库,获得阳性克隆。将阳性克隆进行测序,并且经过BLAST比对等生物信息学分析筛选候选诊断抗原基因；将获得的目的基因扩增,构建重组质粒,进行原核表达与纯化；用间接ELISA方法评价重组蛋白的诊断价值。[结果]从巨片形吸虫cDNA文库初步筛选到56个阳性克隆,经过二筛、三筛以及正常人血清复筛后最终获得19个阳性克隆,经DNA序列测序,通过BLAST分析比对,除去线粒体基因及与其他物种高同源性基因,剩余的11个基因共分为4大类,分别为组织蛋白酶L蛋白(CL)、硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)、鞘脂激活蛋白样蛋白2(SAP2)和卵黄蛋白B2(VB2),其中TPx、SAP2和VB2在以往报道中未见对人体巨片形吸虫病诊断的深入研究,故将TPx、SAP2和VB2进行一步研究。三类重组蛋白均成功表达并纯化,通过间接ELISA法对三类重组蛋白的免疫反应性进行检验,结果显示TPx和SAP2的表达产物有较好的免疫反应性。以纯化并复性的rFgTPx_nt重组蛋白为检测抗原,通过间接ELISA方法检测巨片形吸虫病患者血清中的特异性抗体,该ELISA法的敏感性为66.7%,特异性为96.8%,总体符合率87.6%,与血吸虫病人、华支睾吸虫病人血清交叉反应率分别为0.0%(0/15)和6.7%(1/15)；治疗前后血清OD值分别为0.233±0.088和0.129±0.072,二者存在明显差异(P0.05),表明该抗原具有疗效考核的价值。以rFgSAP2重组蛋白和F.g ESA分别作为包被抗原检测巨片形吸虫病患者血清,SAP2-ELISA法的敏感性为100%,特异性为94.8%,总体符合率95.8%；与血吸虫病、囊虫病、华支睾吸虫病和麝猫后睾病患者血清无交叉反应,但与并殖吸虫病患者血清存在较高的的交叉反应(46.1%,6/13)。FgESA-ELISA法的结果与SAP2的结果基本一致,但与并殖吸虫病患者血清无反应。实验表明：rFgSAP2重组蛋白对巨片形吸虫病具有极高的诊断价值。另外,rFgTPx_nt和rFgSAP2重组蛋白均可识别巨片形吸虫病急性期患者血清,表明该两种抗原具有早期诊断价值。[结论]本研究使用巨片形吸虫病患者血清免疫学筛库得到4类抗原,成功表达TPx、SAP2和VB2三类重组蛋白；通过间接ELISA法进行检测,显示rFgTPx_nt和rFgSAP2重组蛋白有较高的免疫反应性,且皆可用于早期诊断,rFgTPx_nt重组蛋白具有考核疗效作用,rFgSAP2重组蛋白具有极高的诊断价值。
【关键词】：巨片形吸虫 cDNA文库 免疫筛选 重组表达 ELISA
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R532.21
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 前言10-14
• 第一部分 巨片形吸虫病诊断候选抗原基因的筛选与克隆14-44
• 引言14
• 材料与方法14-26
• 结果26-42
• 小结42-44
• 第二部分 巨片形吸虫诊断候选抗原的原核表达及纯化44-64
• 引言44
• 材料与方法44-54
• 结果54-62
• 小结62-64
• 第三部分 重组蛋白的诊断价值的评估64-76
• 引言64
• 材料与方法64-68
• 结果68-75
• 小结75-76
• 讨论76-80
• 结论80-82
• 参考文献82-84
• 致谢84-86
• 附件1 (发表的论文)86-91
• 附件2 (发表的综述)91-95

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本文编号：423822