水中甲肝病毒浓缩方法初探及我国部分流行株遗传特性分析

发布时间：2017-06-08 16:05

  本文关键词：水中甲肝病毒浓缩方法初探及我国部分流行株遗传特性分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：甲型肝炎是由甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus, HAV)引起的以肝脏炎症病变为主的传染性疾病。HAV仅有一个血清型,有六种基因型,主要通过粪口途径传播。水源性或食源性甲肝爆发危害人类的健康,检测食物或水中的HAV对食品安全或饮用水安全具有重要意义。由于水中HAV含量较少,难以直接检测,因此,对水中HAV进行浓缩成为当下研究的热点问题。本研究采用Zetapor阳离子滤膜过滤和聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)沉淀对水中的HAV进行浓缩,之后采用Taqman荧光定量RT-PCR进行检测。对PEG沉淀条件和Zetapor阳离子滤膜过滤条件进行了优化,分别采用加入甲肝减毒活疫苗(Hepatitis A Attenuated Live Vaccine, HepA-L)的超纯水和矿泉水模拟受HAV污染的水样,以不加HepA-L的超纯水或矿泉水作为阴性对照,探讨了玻璃瓶和塑料瓶对HAV浓缩效果的影响。比较不同PEG浓度及氯化钠(NaCl)浓度条件下的浓缩效果发现,当PEG终浓度为10%、NaCl终浓度为1.0M时,PEG沉淀效果较好。比较不同流速条件下Zetapor阳离子滤膜过滤浓缩效果发现,当流速为3L/h时,Zetapor阳离子滤膜的浓缩效果较好。在最优条件下,1.5L超纯水中的HAV经Zetapor阳离子滤膜过滤初次浓缩及PEG沉淀二次浓缩后的检出下限约是0.2 TCID50/mL。以优化后的条件浓缩的总回收率为0.38%～0.88%。盛放待测水样的容器影响Zetapor阳离子滤膜过滤浓缩HAV的效果,塑料瓶对HAV的吸附能力大于玻璃瓶。采用某品牌矿泉水模拟受HAV污染的水样,经二次浓缩后与超纯水中HAV的浓缩结果无差别。本研究优化了Zetapor阳离子滤膜过滤和PEG沉淀浓缩水中HAV的条件,采用荧光定量RT-PCR进行检测；采用加入HepA-L的超纯水和矿泉水模拟受HAV污染的水样,为后续水中HAV浓缩方法的优化提供了一定的实验基础。目前,HAV仅有一个血清型,其中和抗原位点主要位于结构蛋白VP3、VP1区。对HAV流行株结构蛋白区进行基因特征及分子进化等遗传特性分析,可以了解其基因型别和氨基酸序列特点、推导其起源时间和进化速率,为HAV的溯源研究及甲肝的预防控制策略提供有力的理论和技术支持。本研究从我国4个省份收集的39份2012年-2014年甲肝患者急性期血清样本及2份国产市售甲肝减毒活疫苗(Hepatitis A Attenuated Live Vaccine, HepA-L)标本中提取HAV核酸,经逆转录、PCR扩增得到HAV结构-非结构蛋白区VP3～VP1-2A编码区核苷酸序列,进行基因亲缘关系及核苷酸序列同源性、氨基酸序列同源性、选择压力、分子进化等分析。本研究检测到的39条HAV流行株序列均为IA亚型,其在结构-非结构蛋白VP3～VP1-2A编码区核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.8%～100%和99.3%～100%,与检测的2份HepA-L标本的核苷酸和氨基酸序列同源性为90.6%～91.9%和99.1%～99.4%。其中的1条序列在VP3-56位,发生丝氨酸(Serine,Ser)→脯氨酸(Proline, Pro)替代；3条序列在VP1-112位,发生苏氨酸(Threonine,Thr)→异亮氨酸(Isoleucine, Ile)替代,靠近中和抗原位点VP1-114位；所有序列在已发表的中和抗原位点处氨基酸无变化。选择压力分析表明,检测到的HAV流行株序列在VP3～VP1编码区处于负向选择。检测的2份HepA-L标本序列均为IB亚型,在己发表的中和抗原位点处氨基酸无变化。基于结构-非结构蛋白VP3～VP1-2A区核苷酸序列,对包括本研究30条HAV流行株序列在内的我国基因Ⅰ型HAV流行株进行分子进化分析,在最优模型下,我国基因Ⅰ型HAV的平均替换率为5.56×10-4 substitutions/site/year,其最早共同祖先约是180年前。Bayesian Skyline曲线显示自20世纪90年代中期至今,我国基因Ⅰ型HAV的种群数量呈明显下降趋势。本研究对我国部分HAV流行株结构蛋白区进行了基因特征及分子进化等遗传特性分析,证实了HAV的结构蛋白区核苷酸序列存在一定差异,但氨基酸序列相对保守,HAV流行株在该区内处于负向选择,同时对我国基因Ⅰ型HAV的进化有一定的了解,为进一步研究HAV的分子流行病学和全面了解我国HAV进化提供了基础。
【关键词】：甲型肝炎病毒 水 浓缩 基因特征 分子进化
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.61
【目录】：

• 英文缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 第一部分 水中甲肝病毒浓缩方法初探12-38
• 前言12-15
• 实验材料15-17
• 实验方法17-24
• 实验结果24-34
• 实验讨论34-37
• 小结37-38
• 第二部分 我国部分甲肝病毒流行株遗传特性分析38-64
• 前言38-41
• 实验材料41-43
• 实验方法43-51
• 实验结果51-60
• 实验讨论60-63
• 小结63-64
• 参考文献64-67
• 综述：环境水体中甲型肝炎病毒的浓缩方法研究进展67-74
• 1. 吸附洗脱法67-69
• 2. 超滤法69
• 3. 超速离心法69-70
• 4. 聚乙二醇沉淀法70
• 5. 新方法70-71
• 6. 总结与展望71-72
• 参考文献72-74
• 致谢74

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本文编号：433003