Dectin-1重组腺病毒对侵袭性肺曲霉病免疫保护作用的实验研究

发布时间：2017-06-13 11:06

  本文关键词：Dectin-1重组腺病毒对侵袭性肺曲霉病免疫保护作用的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景真菌广泛分布在我们生活的环境中,曲霉占空气中真菌的12%左右。正常人体每天都能吸入一定量的真菌孢子,但是由于机体存在完善的免疫防御机制,能很好的清除进入体内的孢子,所以免疫力正常的人群不易罹患侵袭性真菌病。但是,近年来由于肿瘤化疗和器官移植等免疫缺陷患者增多以及广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂等的广泛使用,导致侵袭性真菌感染发病率逐年增加。来自我国的一项多中心研究发现,根据目前公认的侵袭性真菌感染的确诊和临床诊断标准,在非血液恶性疾病患者中位于前7位的肺真菌病依次为肺曲霉病、肺念珠菌病、肺隐球菌病、肺孢子菌病、肺毛霉病、肺马内菲青霉病、组织胞浆菌病。侵袭性肺曲霉病的主要病理改变为曲霉菌丝在肺组织内增殖并侵入血管,导致坏死性血管炎,造成血栓和出血,导致血行播散。侵袭性肺曲霉病病情发展迅速,病死率高。即使通过不断改进检测手段早期诊断,采取预防性治疗和经验性治疗等措施,其病死率仍高达50%-90%。尽管近年抗真菌药物研究取得很大进步,但仍面临治疗有效率低和耐药菌不断产生等问题。当前免疫治疗已成为感染性疾病的重要防治手段之一。目前临床上已开始一些免疫调节治疗以辅助抗真菌治疗,包括给予粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素(INF)-γ等,并取得了一定的疗效。对机体免疫防御反应研究的不断深化,宿主天然免疫功能及其组成的免疫屏障在烟曲霉感染过程中发挥的防御作用逐步受到重视,将促使更多的研究从干预宿主免疫功能的角度,为侵袭性曲霉病防治提供新的思路。天然免疫对病原体的识别是非特异性的,主要依赖于模式识别受体去识别病原体表面共有的高度保守的分子结构(病原相关分子模式)。Toll样受体(TLRs)和C型凝集素受体(CLRs)家族是参与抗真菌免疫的主要模式识别受体。树突状细胞相关性C型凝集素-1(Dectin-1)属于CLRs家族中研究最为广泛和深入的。Dectin-1受体首先在巨噬细胞表面被发现,广泛分布于巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞等表面。Dectin-1受体可以识别并结合烟曲霉细胞壁成分p-葡聚糖。在细胞水平阻断Dectin-1受体,中性粒细胞与烟曲霉孢子共孵育后,显示更低的炎症因子表达,更高的真菌负荷。体内实验也提示,Dectin-1基因敲除小鼠在烟曲霉感染后期炎症因子、真菌负荷及死亡率均明显升高。既往上皮细胞被认为仅仅起到免疫屏障的作用,但随着研究的深入,人们已了解上皮细胞能够和骨髓来源的细胞一样通过表面的模式识别受体对病原体进行识别,并诱导免疫反应,产生一些炎症因子及抗菌物质。消化道粘膜上皮细胞在受到病原体入侵时,能上调表达TLRs等,产生抗菌肽和细胞因子等免疫分子,发挥积极抗菌作用。未受烟曲霉孢子刺激的情况下,气道上皮细胞膜表面Dectin-1表达水平低,烟曲霉孢子刺激后能够启动表达Dectin-1受体,通过siRNA沉默Dectin-1表达后,证明Dectin-1的上调表达在炎症趋化因子、抗菌肽和活性氧释放过程中发挥重要作用。随着许多关于基因治疗的动物研究及临床试验研究成功开展,使得基因治疗在疾病治疗方面的应用得到广泛关注。目前基因治疗的载体主要分为病毒载体和非病毒载体,病毒载体相较于非病毒载体转染效率高。腺病毒载体又由于具有可以转染非分裂期细胞,遗传毒性低,对肺组织具有亲嗜性等优点,广泛应用于呼吸系统疾病基因治疗的研究。基于Dectin-1在抗曲霉免疫中的重要作用和腺病毒载体基因治疗的广泛应用。本研究通过气管内注射给药的方式将Dectin-1重组腺病毒载体投送至小鼠肺部以构建Dectin-1气道上调表达小鼠模型,通过免疫组化及Real-timePCR技术验证Dectin-1表达,并对给予载体后安全性进行评价。同时,进一步研究Dectin-1重组腺病毒载体在烟曲霉感染中的作用,并通过测定炎症因子、组织病理、真菌负荷、生存时间等方面评价其免疫保护作用。第一部分Dectin-1重组腺病毒小鼠体外表达模型的鉴定及安全性研究目的采用气管内注射给予Dectin-1重组腺病毒的方法建立气道Dectin-1上调表达小鼠模型,进一步验证模型和评价其安全性。方法BALB/c小鼠分为PBS组、Ad-EGFP(recombinant adenovirus encoding enhanced green fluorescent protein)组、Ad-mDectin-1(recombinant adenovirus encoding murine Dectin-1)组,分别经气管给予PBS、Ad-EGFP、 Ad-mDectin-1.PBS组及Ad-EGFP组为对照组。在给药后第3d,通过Real-time PCR检测各组肺组织Dectin-1 mRNA水平,通过免疫组化检测各组肺组织Dectin-1蛋白分布及表达水平,通过ELISA检测各组肺组织匀浆及血液中白细胞介素(IL)-6水平,通过激光共聚焦检测腺病毒载体在肺组织及肝脏的分布情况。继续通过免疫组化检测在给药后第5、7、14d各组肺组织Dectin-1水平变化。通过Image-Pro Plus 6.0分析气管壁Dectin-1积分光密度变化情况。结果通过采用气管内给药方式,在第3d可以观察到Ad-mDectin-1组小鼠肺组织Dectin-1 mRNA水平约为PBS组、Ad-EGFP组的18倍。Ad-mDectin-1组与对照组比较差异具有统计学意义(Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组,P=0.012；Ad-mDectin-1组vsPBS组,P=0.011)。对照组之间比较差异无统计学意义(P=0.994)。在经气道给药后第3、5、7、14d,Ad-mDectin-1组可观察到Dectin-1主要定位于细支气管,可见棕黄色阳性颗粒位于胞浆及胞膜。而肺泡上皮未发现明显阳性颗粒沉着。对照组均未见肺上皮细胞有棕黄色阳性颗粒沉着。在Ad-mDectin-1组中可以观察到Dectin-1水平逐渐增高,在第5d达高峰,第14d气道上皮细胞仍有Dectin-1表达。通过Image Pro Plus 6.0软件进行分析发现,平均光密度值从第3d开始上升,并在第5d达高峰,第14d明显下降。各时间点比较发现第5、7d与第3、14d比较差异有统计学意义(第5、7d vs 第3、14d,P0.001)。在给药后第3d,通过激光共聚焦显微镜观察Ad-mDectin-1在全身的分布情况。结果显示在肺组织中Ad-mDectin-1组及Ad-EGFP组均可发现绿色荧光,而PBS组肺组织未见绿色荧光。在肝脏组织中,各组均未发现绿色荧光蛋白。肺组织及血清中工L-6水平显示,Ad-mDectin-1组IL-6水平较PBS及Ad-EGFP对照组无明显差异(Ad-mDectin-1组 vs PBS组,P=0.875; Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组,P=0.598)。同时检测血清中IL-6水平未见明显变化。结论通过气管内给予Ad-mDectin-1成功上调小鼠肺组织Dectin-1水平,Dectin-1主要表达于细支气管上皮细胞,表达高峰在第5d,可持续2w以上。同时给予Ad-mDectin-1后对小鼠生存和活动无明显影响,未造成明显炎症反应及远隔器官肝脏的播散。第二部分Dectin-1重组腺病毒对侵袭性肺曲霉病的免疫保护作用目的通过预先给予Dectin-1重组腺病毒,研究其对小鼠侵袭性肺曲霉病的免疫保护作用。方法BALB/c小鼠分为PBS组、Ad-EGFP组、Ad-mDectin-1组,分别醛气管给予PBS、Ad-EGFP、Ad-mDectin-1。PBS组及Ad-EGFP组为对照组。1d后经腹腔注射环磷酰胺构建免疫缺陷小鼠,4d后建成免疫缺陷小鼠模型,此时经气管给予3×105pfu烟曲霉孢子。给予曲霉孢子后第二天收集肺组织及肺泡灌洗液。应用ELISA检测肺组织及肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子(TNF)-a及GM-CSF水平；Real-time PCR检测肺组织Dectin-1 mRNA、IL-1β mRNA及IL-10 mRNA水平；HE染色及六胺银(GMS)染色分析肺组织炎症变化及肺部真菌水平；平板菌落计数评估各组真菌负荷；肺组织髓过氧化物酶(MPO)活力检测分析肺组织中性粒细胞水平；并进一步研究给予Ad-mDectin-1对烟曲霉感染小鼠生存率的影响。结果ELISA检测发现各组肺组织及肺泡灌洗液中TNF-α水平无明显差异(肺组织中P=0.215,肺泡灌洗液中P=0.906),而Ad-mDectin-1组GM-CSF水平在肺组织和肺泡灌洗液中均较对照组升高,差异具有统计学意义(肺组织中：Ad-mDectin-1组vs PBS组,P0.001；Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组,P0.001。肺泡灌洗液中：Ad-mDectin-1组vs PBS组,P=0.002；Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组,P=0.003)。Real-time PCR检测各组肺组织中Dectin-1、IL-1β、IL-10水平。Ad-mDectin-1组肺组织Dectin-lmRNA水平高于对照组,差异具有统计学意义(Ad-mDectin-1组vs PBS组,P=0.043；Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组,P=0.031)。肺组织IL-1β mRNA水平在Ad-mDectin-1组(7.8087±1.6716)明显升高,约为对照组IL-1β mRNA水平(PBS组：2.6247±0.9735：Ad-EGFP组：3.0693±1.6587)的2.7倍,差异具有统计学意义(Ad-mDectin-1组vs PBS组,P0.001；Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组,P0.001)。肺组织IL-lOmRNA水平,Ad-mDectin-1组与对照组无明显差异(P=0.997)。HE染色提示Ad-mDectin-1组的小鼠肺组织表现出更明显的炎症反应,肺泡间隔增厚,炎性细胞渗出明显,并可观察到红细胞渗出,GMS染色显示Ad-mDectin-1组肺组织中的真菌数量也较对照组明显减少。相对于PBS组及Ad-EGFP组,Ad-mDectin-1组肺组织中孢子和菌丝的数量明显减少。通过肺组织平板菌落计数试验进一步验证了上述结论,Ad-mDectin-1组真菌负荷(5.7657±0.144)约为对照组(PBS组：6.0721±0.198；Ad-EGFP组：6.0721±0.227)的38.15%,差异具有统计学意义(Ad-mDectin-1组vs PBS组,P=0.007；Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组,P=0.007)。肺组织MPO检测提示,Ad-mDectin-1组小鼠肺组织MPO活力(0.3987±0.055)较PBS组(0.2964±0.026)及Ad-EGFP组(0.3011±0.033)明显升高,且差异具有统计学意义(Ad-mDectin-1组vs PBS组,P=0.03；Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组,P=0.036)。生存分析结果显示PBS组的生存率为50%,Ad-EGFP组的生存率为60%,Ad-mDectin-1组无小鼠死亡,生存率为100%。各组之间比较提示Dectin-1生存率相对于对照组差异具有统计学意义(Ad-mDectin-1组vs PBS组,P=0.012;Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组,P=0.029;PBS组vs Ad-EGFP组,P=0.796)。结论Ad-mDectin-1能够通过上调气道Dectin-1表达后提高烟曲霉感染小鼠肺组织IL-1β及GM-CSF水平,募集大量中性粒细胞向肺内感染病灶聚集,减轻肺内真菌负荷,提高烟曲霉感染生存率。
【关键词】：Dectin-1 腺病毒载体 基因治疗 侵袭性肺曲霉病 天然免疫
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R519.8
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-30
• 参考文献25-30
• 第一章 Dectin-1重组腺病毒小鼠体外表达模型鉴定及安全性研究30-49
• 材料30-31
• 方法31-37
• 结果37-43
• 讨论43-46
• 结论46
• 参考文献46-49
• 第二章 Dectin-1重组腺病毒对侵袭性肺曲霉病免疫保护作用49-69
• 材料49-51
• 方法51-55
• 结果55-60
• 讨论60-64
• 结论64
• 参考文献64-69
• 全文总结69-71
• 英文缩略词71-72
• 附录72-84
• 参考文献80-84
• 攻读硕士学位期间成果84-85
• 致谢85-86

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Cheng-Ye Che;Cui Li;Ang Gao;Jing Lin;Li-Li Zhang;Qiang Xu;Qian Wang;Gui-Qiu Zhao;;Dectin-1 expression at early period of Aspergillus fumigatus infection in rat's corneal epithelium[J];International Journal of Ophthalmology(English Edition);2013年01期

  本文关键词：Dectin-1重组腺病毒对侵袭性肺曲霉病免疫保护作用的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：446378