发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白、核蛋白真核表达载体的构建及其生物学活性的研究

发布时间：2017-06-29 14:10

  本文关键词：发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白、核蛋白真核表达载体的构建及其生物学活性的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS),是一种新发出血热性传染病,由一种新的布尼亚病毒,简称SFTSV引起。SFTS每年的发病率大约是每10万农村人口中有5人发病,主要感染中老年人,病死率平均是12%。自2009年在中国发现以来,SFTSV已在韩国和日本报道,相似病毒在美国报道。SFTSV是布尼亚病毒科白蛉病毒属的单股负链RNA病毒,包含L、M、S三个片段,分别编码RNA聚合酶、糖蛋白(Gn、Gc)前体、核蛋白NP和非结构蛋白NSs。其中Gn、Gc最可能诱导中和抗体的产生,目前已有研究发现能结合M片段的单克隆抗体(MAb4-5)可以中和SFTSV;而S片段最为保守,NP最易表达,常被用来做免疫检测用。本研究旨在构建NP、Gn、Gc及M片段分段蛋白的真核表达载体,表达相应蛋白,从抗原性和免疫原性方面检测NP的生物学活性,为进一步研究中和抗体做好铺垫。目的1、构建核蛋白NP,糖蛋白Gn、Gc真核表达载体。2、构建M片段(编码糖蛋白)分段真核表达载体。3、表达核蛋白,研究重组核蛋白NP的生物学活性。方法1、设计引物扩增NP、Gn和Gc。2、设计引物分20段扩增M片段(M1-M20),每段重叠30个碱基。3、设计引物分别扩增NP、Gn和M1,建立与GFP的融合蛋白序列,监测蛋白表达情况。3、将目的基因与克隆载体19T(Simple)连接扩增后,再与表达载体pVAX1连接。4、将目的基因-pVAX1构建的表达载体用阳性脂质体法转染至Vero细胞,在Vero细胞内表达,用Western blot、间接免疫荧光、显微镜观察融合蛋白荧光的方法检测蛋白表达,用镍柱纯化带His标签的NP。5、包被纯化的NP,包被板与商品化试剂盒同时检测羊血清中SFTSV抗体,比较检测的效果。6、用纯化的NP免疫BALB/c小鼠,测定血清滴度。结果1、构建出核蛋白NP,糖蛋白Gn、Gc, M片段分段蛋白的真核表达载体,构建出NP、Gn、Gc、M1分别和GFP的融合蛋白表达载体,测序正确。检测到上述蛋白在Vero细胞中的表达。2、用NP自行包被的包被板与商品化的试剂盒在检测羊血清阳性率的效果上,没有统计学差异。3、用NP免疫BALB/c小鼠获得有效阳性血清。结论1、构建的pVAX1真核表达载体,转染Vero细胞后可表达NP、Gn、Gc及M片段的分段蛋白,但M片段编码的蛋白表达量较低。2、用pVAX1构建的表达载体在Vero细胞中表达出的NP在ELISA和免疫动物方面具有良好的生物学活性。
【关键词】：发热伴血小板减少综合征 布尼亚病毒 糖蛋白 核蛋白 真核表达 生物学活性
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.8
【目录】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 符号说明11-13
• 第一章 前言13-16
• 第二章 材料与方法16-49
• 2.1 材料16-28
• 2.2 方法28-49
• 第三章 结果49-61
• 3.1 目的基因的扩增49-50
• 3.2 含目的基因的克隆载体和真核表达载体的构建及序列分析50-52
• 3.3 重组蛋白的表达和鉴定52-57
• 3.4 重组蛋白NP表达产物的纯化57-58
• 3.5 重组蛋白NP在ELISA应用中的研究58-60
• 3.6 重组蛋白NP的免疫原性研究60-61
• 第四章 讨论61-64
• 第五章 结论64-65
• 参考文献65-69
• 致谢69-70
• 攻读学位期间发表的学术论文70-71
• 附件71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 卢静;李川;张福顺;芜为;张全福;张黎;王涛;王芹;仇佩虹;梁米芳;李德新;;发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结构和非结构蛋白表达研究[J];病毒学报;2011年06期

2 迟媛媛;翟慎勇;温红玲;崔峰;宋艳艳;王玲;杜俊;曹海霞;王谦;张寿锋;于学杰;赵丽;;发热伴血小板减少综合征患者血清中新型布尼亚病毒RNA的检测[J];山东大学学报(医学版);2012年11期

3 揭盛华;周艳;孙立平;梁凯威;易小玲;李慧玉;;Close Correlation between Development of MODS during the Initial 72h of Hospitalization and Hospital Mortality in Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年01期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 冯岑;SFTSV全基因组序列及其核衣壳蛋白的原核表达分析[D];浙江师范大学;2014年

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本文编号：498148