脊髓灰质炎病毒株假病毒颗粒的研究和适用

发布时间：2017-07-30 08:17

  本文关键词：脊髓灰质炎病毒株假病毒颗粒的研究和适用

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【摘要】：脊髓灰质炎病毒(简称脊灰病毒)感染可引起急性肠道传染病脊髓灰质炎(简称脊灰),其主要病状为肢体麻痹、下肢发育不全和功能障碍,并造成终身残疾。脊髓灰质炎减毒活疫苗(Oral Polio Vaccine,OPV)和脊髓灰质炎灭活苗(Inactive Polio Vaccine,IPV)是主要的流行病学预防手段。但是,在使用OPV的国家发现了罕见的疫苗相关麻痹型脊灰和疫苗衍生脊灰病毒病例,这提示我们进一步加强对疫苗生产的质量控制力度十分必要,准确排查疑似脊灰患者的手段仍需加强。本研究旨在构建三型脊髓灰质炎病毒株(sabin I型、sabin II型和sabin III型)的假病毒颗粒Armored RNA-sab I、Armored RNA-sab II和Armored RNA-sab III,并以构建得到的假病毒颗粒作为实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)的阳性标准品,实现对待测样本中脊髓灰质炎病毒拷贝数的测定。本研究中使用PAR工程质粒作为载体,分别连接脊髓灰质炎病毒株sabin I型、sabin II型和sabin III型的特异基因片段sab I、sab II、sab III,得到的重组质粒转化后筛选阳性克隆。经鉴定的重组菌株在LB培养基中振荡培养、诱导后富集菌体,然后进行裂解和核酸酶处理,制备假病毒颗粒Armored RNA-sab I、Armored RNA-sab II和Armored RNA-sab III的粗提液。假病毒颗粒粗提液经核酸水平和蛋白质水平检测后,用来制作q RT-PCR标准曲线的标准品发挥其适用功能。
【关键词】：假病毒颗粒 脊髓灰质炎病毒 实时荧光定量聚合酶链式反应 标准品
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.4
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 第1章 绪论8-14
• 1.1 课题背景及研究的目的和意义8-10
• 1.1.1 脊髓灰质炎和脊髓灰质炎病毒8-9
• 1.1.2 脊髓灰质炎疫苗和减毒活疫苗质控9-10
• 1.2 假病毒颗粒及其相关理论的发展概况10-11
• 1.3 TA克隆11
• 1.4 实时荧光定量聚合酶链式反应11-12
• 1.5 本文的主要研究内容12
• 1.6 本文的技术路线12-14
• 第2章 实验材料与方法14-38
• 2.1 实验材料14-22
• 2.1.1 病毒株、菌种、细胞、国家标准品14
• 2.1.2 载体14-15
• 2.1.3 主要仪器与耗材15-16
• 2.1.4 主要试剂及其配制16-22
• 2.1.5 设计软件和分析软件22
• 2.2 实验方法22-38
• 2.2.1 构建重组质粒22-30
• 2.2.2 制备假病毒颗粒30-31
• 2.2.3 western blotting和蛋白质显色31-34
• 2.2.4 病毒滴度测定34
• 2.2.5 实时荧光定量聚合酶链式反应34-37
• 2.2.6 假病毒颗粒对RNase耐受的检验37-38
• 第3章 构建重组质粒和诱导假病毒颗粒的表达38-48
• 3.1 引言38
• 3.2 特异性扩增脊髓灰质炎病毒目的片段38-39
• 3.3 构建重组质粒39-44
• 3.3.1 中间重组质粒的鉴定39-40
• 3.3.2 重组质粒的鉴定与全长测序40-44
• 3.3.3 重组菌株保种44
• 3.4 诱导条件44-46
• 3.4.1 诱导剂终浓度与诱导表达丰度的关系44-45
• 3.4.2 诱导时间与诱导表达丰度的关系45-46
• 3.5 假病毒颗粒粗提液的制备46
• 3.6 本章小结与讨论46-48
• 第4章 假病毒颗粒的定性检测48-54
• 4.1 引言48
• 4.2 假病毒颗粒的蛋白质水平定性检测48-52
• 4.2.1 蛋白质免疫印迹实验及其它染色实验48-49
• 4.2.2 假病毒颗粒的形态学观察49-52
• 4.3 假病毒颗粒的核酸水平定性检测52-53
• 4.3.1 假病毒颗粒的核糖核酸酶耐受52
• 4.3.2 假病毒颗粒纯化后的溴化乙锭染色52-53
• 4.4 本章小结与讨论53-54
• 第5章 假病毒颗粒的定量检测与适用54-62
• 5.1 引言54
• 5.2 实时荧光定量PCR测定假病毒颗粒拷贝数54-58
• 5.3 脊髓灰质炎病毒株国家标准品的拷贝数测定58-59
• 5.4 脊髓灰质炎病毒株国家标准品的滴度测定59
• 5.5 温度敏感性试验59-60
• 5.6 假病毒颗粒的型特异性分析60-61
• 5.7 本章小结与讨论61-62
• 结论62-63
• 参考文献63-67
• 致谢67-68
• 附录68-76

【引证文献】

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 范行良;刘悦越;国泰;;脊髓灰质炎疫苗现状概述[A];2013年中国药学大会暨第十三届中国药师周论文集[C];2013年

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本文编号：593263