尾加压素Ⅱ对肺动脉平滑肌细胞胶原合成的影响及其细胞内信号转导的研究

发布时间：2017-10-14 02:16

  本文关键词：尾加压素Ⅱ对肺动脉平滑肌细胞胶原合成的影响及其细胞内信号转导的研究

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【摘要】：研究背景及目的 肺动脉高压是各种原因引起的静息状态下右心导管测得的肺动脉平均压(mean pulmonary arterial pressure mPAP)≥25mmHg的一组临床病理生理综合症。先天性心脏病是小儿最常见的心脏病,在1000个出生存活婴儿中,发生本病者约6-8名,中国每年大约有15万新生婴儿患有各种类型的先天性心脏病(congenital heart disease, CHD),而肺动脉高压是CHD常见且严重的并发症。房间隔缺损(atrial septal defect, ASD).室间隔缺损(ventricular septal defect, VSD)及动脉导管未闭(patent ductus arteriosus, PDA)是儿童常见左向右分流型CHD,随着病情进展,肺循环血流量持续增加,逐渐形成肺动脉高压,发展成为艾森曼格(Eisenmenger)综合症,伴有肺动脉高压的CHD患者手术风险性及死亡率明显增加,甚至失去手术机会。目前对肺动脉高压尚无有效的治疗方法。肺动脉高压的特征性病理改变为肺血管收缩反应增强及肺血管结构重建。肺血管收缩反应增强属功能性改变,是可逆的；肺血管结构重建是肺动脉平滑肌细胞肥大、增殖及胶原等细胞外间质沉积引起肺血管管壁增厚,管腔狭窄,属结构性改变,是不可逆的。 近二十多年来,UⅡrotensinⅡ,UⅡ)从1985年自硬骨鱼尾垂腺中分离出到如今作为人类心血管疾病病理生理过程中的一种重要调节因子而被广泛关注研究证实体内一种孤立的G蛋白藕联受体—GPR14是UⅡ的特异性受体(UT),UⅡ及其受体广泛分布于人体的心血管系统、中枢神经系统、肾脏、胰腺等多种组织。UⅡ与UT结合,能够引起一系列生物学效应,包括血管收缩,促血管平滑肌细胞、成纤维细胞及癌细胞的增殖及细胞的迁移等。UⅡ在肺动脉高压形成过程中起重要作用,且目前己发现UT受体特异性抑制剂Urantide,可以拮抗UⅡ的上述作用。但UⅡ及其受体拮抗剂Urantide对培养的Wistar大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及其对肺动脉平滑肌细胞I、Ⅲ型胶原合成的影响尚未见报道,UⅡ及其受体拮抗剂Urantide调节肺动脉平滑肌细胞胶原合成的细胞内信号转导机制尚未见报道。 本研究的目的是研究尾加压素Ⅱ(Urotensi n Ⅱ,U Ⅱ)及其受体拮抗剂Uranti de对培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖及I、Ⅲ型胶原(collagen Ⅰ.Ⅲ)合成的影响,探讨细胞外信号调节激酶途径(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)是否参与了促肺动脉平滑肌细胞增殖及胶原合成增加过程。为Urantide通过阻止UⅡ的促增殖作用来实现其延缓肺动脉高压发生发展的说法提供理论依据。 方法 1.动物选择：取120g左右健康雄性Wistar大鼠,行肺动脉平滑肌细胞分离并进行原代培养,经Rabbit anti-α-actin单克隆抗体及FITC免疫荧光进行细胞鉴定。 2.肺动脉平滑肌细胞原代培养：以组织贴块法培养的大鼠PASMCs为研究对象,分为不同实验组：①UⅡ作用组：将不同浓度(10-10mol/L～10-7mol/L)UⅡ加入细胞培养孔,(每个浓度n=5),观察UⅡ对PASMCs增殖的影响；②Urantide阻断组：10-7mol/L Urantide作用30min后加入10-7mol/L UⅡ继续作用24h(n=5),观察Urantide对UⅡ的拮抗作用；③PD98059抑制组：10-5mol/L PD98059作用30min后加入10-7mol/LUⅡ继续作用2h(n=5),观察PD98059对磷酸化ERK1/2的抑制作用；④对照组：未加入UⅡ及其受体拮抗剂(n=5)。 3.培养PASMCs增殖：采用CCK-8法及BrdU掺入实验测定UⅡ及Urantide对培养大鼠PASMCs增殖的影响。 4.实时定量PCR检测UⅡ及Urantide对肺动脉平滑肌细胞I、Ⅲ型胶原及p-ERK1/2基因表达的影响,同时测定PD98059对p-ERK1/2基因表达的影响。 5.Western blotting测定UⅡ及Urantide对培养大鼠PASMCs Ⅰ、Ⅲ胶原及磷酸化ERKl/2蛋白表达的影响,同时检测PD98059对磷酸化ERK1/2蛋白表达的影响。 结果 1.本研究通过组织贴块法成功原代培养出肺动脉平滑肌细胞,经Rabbit anti-α-actin单克隆抗体及FITC免疫荧光对培养的细胞进行鉴定,其纯度达95%。 2.CCK-8细胞生长测定及BrdU掺入实验结果显示：不同浓度的UⅡ(10-9mol/L～10-7mol/L)可浓度依赖性地促进PASMCs的增殖(P0.05,P0.001),其中UⅡ(10-7mol/L),促增殖作用最明显(P0.001)；UⅡ(10-10mol/L)无明显促细胞增殖作用(P0.05).Real-time PCR检测结果发现：UⅡ浓度依赖性地增加PASMCs Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达；Western blotting结果显示：UⅡ可浓度依赖性地增加PASMCs Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达(P0.05,P0.001)。其中UⅡ(10-7mol/L),促胶原合成作用最明显(P0.001),UⅡ(10-100mol/L)无明显促胶原合成作用(P0.05)。 3.Real-time PCR及Western blotting分别从基因及蛋白水平检测发现：UⅡ可诱导ERKl/2磷酸化,细胞外信号调节激酶抑制剂PD98059可显著抑制磷酸化ERK1/2基因及蛋白表达(P0.05,P0.001)。 4.UⅡ受体拮抗剂Urantide可抑制UⅡ的促肺动脉平滑肌细胞增殖,促IⅢ兀型胶原合成作用及诱导ERK1/2磷酸化作用。(P0.01,P0.05)。 结论 1.本研究成功分离并培养了大鼠肺动脉平滑肌细胞,培养细胞纯度达95%是良好的实验材料,提高了实验的可行性及准确性。 2.UⅡ浓度依赖性地促进PASMCs增殖,增加PASMCs Ⅰ、Ⅲ胶原的基因及蛋白水平的表达。 3.UⅡ上调ERK1/2磷酸化水平,ERK1/2拮抗剂PD98059可抑制UⅡ的促进作用。说明细胞外信号调节激酶信号通路参与了PASMCs增殖及胶原合成过程。 4.UⅡ受体拮抗剂Urantide可拮抗UⅡ的促增殖、促胶原合成及诱导ERK1/2磷酸化作用。说明UⅡ与其受体结合后,通过诱导ERK1/2磷酸化激活ERKl/2途径,进而诱导肺动脉平滑肌细胞增殖及I、Ⅲ胶原合成增加。
【关键词】：尾加压素Ⅱ 肺动脉平滑肌细胞 胶原合成 细胞外信号调节激酶 肺动脉高压 大鼠 Wistar
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R725.4
【目录】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 缩写说明12-13
• 前言13-15
• 实验方法15-27
• 结果27-29
• 讨论29-35
• 结论35-36
• 附图表36-45
• 参考文献45-48
• 综述48-54
• 参考文献52-54
• 致谢54-55
• 攻读硕士学位论文期间发表的论文55-56
• 学位论文评阅及答辩情况表56

【参考文献】

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1 张正浩,张孙曦,李菊香,何其华,牛大地,王述Y，

本文编号：1028417