医用臭氧对斑马鱼幼鱼缺氧脑损伤的影响

发布时间：2017-11-05 03:01

  本文关键词：医用臭氧对斑马鱼幼鱼缺氧脑损伤的影响

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【摘要】：[研究背景]新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是指围生期各种因素,主要是指窒息,引起的新生儿脑能量代谢及功能障碍,重者出现严重的临床症状,如抽搐、昏迷等,甚至在婴儿期死亡,幸存者可出现神经系统后遗症,HIE是儿童致残的重要原因。尽管目前围生医学在不断的进步,围产期窒息患儿发生率在逐渐减少,但HIE仍是一种威胁婴幼儿健康的严重疾病,目前尚无特效治疗。在国外亚低温治疗已经成为新生儿脑损伤的常规治疗,方法有选择性头部降温或全身降温。但TaginMA等进行Meta分析时,总结多项临床试验表明亚低温治疗对新生儿中度脑病作用显著,对新生儿重度脑病作用不明显。亚低温虽然在国外广泛用于临床,但在国内还未全面推广,作为临床医师要认清其禁忌症及并发症,选择亚低温治疗时要确保再灌注损伤阶段的各种生理病理反应已减轻。当患儿存在严重感染,凝血功能障碍或多器官功能衰竭时要慎重选择该治疗方案。同时要注意治疗时间窗的选择,一般在出生后6小时内,如果延迟至发病后8.5小时,亚低温治疗则没有神经保护作用。在国内被认为能够有效改善HIE患儿预后的治疗方法是高压氧(HBO)治疗,它能改善患儿的神经系统症状,降低病死率和幸存患儿后遗症发生率。国内大量的临床研究肯定了HBO对新生儿HIE的近期疗效较好,但缺乏多中心随机研究,关于HBO的远期疗效报道少。然而,国外医学并不十分支持HBO在临床的应用,他们认为HBO在治疗局部缺血性脑卒中时能改善神经行为和梗死面积,但应用到临床上尚需要更多的临床前研究证明HBO的有效性及作用机制。其它治疗方法如氧自由基抑制剂和清除剂,兴奋性氨基酸拮抗剂、神经保护剂、干细胞移植、基因治疗等尚需更多的动物研究和临床验证。臭氧用于消毒和治疗疾病有150年的历史了。1840年德国化学家C.F.Schonbein电解水的时候发现一种特殊臭味的气体,将它命名为臭氧。在一战期间,德国士兵将臭氧用于治疗厌氧菌感染所致的气性坏疽,发现臭氧能控制感染,有抗炎的特性。1857年,两位德国物理学家发明第一台医用臭氧发生机,臭氧治疗开始用于临床。1929年美国出版了一本名为《臭氧及其医疗作用》的书,书中描述了臭氧能治疗114种疾病。上个世纪50年代,由于缺乏基础和临床研究及臭氧本身存在的危害,臭氧的治疗效果受到各界的质疑。后来随着医学研究的不断进展,积累了大量研究结果,其作用机制及效果逐渐被阐明,医用臭氧逐渐被医学工作者认可。1999年,意大利发起并建立了国际臭氧医疗协会(IMOS),旨在促进医用臭氧在临床的研究与应用,制定臭氧治疗规范。目前臭氧主要用于治疗腰椎间盘突出、关节痛、肩周炎、糖尿病溃疡等疾病。臭氧在细胞有氧代谢及抗氧化防御系统方面起积极的作用,是治疗能量衰竭有关疾病的基础。臭氧能减少血胆固醇,刺激抗氧化应答,在静止肌修饰氧合作用,改善神经功能,是缺氧和缺血综合征的补充治疗。动物,如大鼠、小鼠、兔、猴,对人类生物的研究有巨大的贡献。除了人们熟悉的鼠、兔等动物外,斑马鱼作为一种逐渐兴起的脊椎模式动物,凭借其节约成本、繁殖能力强、体积小、发育迅速、胚胎透明能够轻易连续观察发育阶段以及其基因与人类基因高度相似等特点已成为生物学家的新选择。斑马鱼基因表达是保守的,与人类有69%的同源性,47%的人类基因与斑马鱼同源基因一一对应。通过检测3176个人类致病基因,发现其中有82%在斑马鱼至少有一个同源基因。这也就意味着在斑马鱼身上进行的实验所得到的结果在多数情况下也适于人体,所以斑马鱼模型可以用于人类疾病的研究。斑马鱼可以模拟多种人类疾病,已有研究者利用斑马鱼胚胎和成鱼制作缺氧缺血性脑损伤模型,研究其发病机制及治疗方法。[研究目的和意义]基于以上的研究背景,本实验旨在利用便捷、高效的斑马鱼模型构建斑马鱼幼鱼缺氧再灌注损伤模型,模拟新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD),探讨应用医用臭氧对新生儿脑损伤的作用机制及影响。本研究通过观察对脑组织氧化应激指标(超氧化物歧化酶(SOD)活性、(丙二醛)MDA、总抗氧化水平)及SODmRNA表达水平的影响,结合斑马鱼幼鱼行为及病理学改变,探讨医用臭氧对缺氧性脑损伤的斑马鱼幼鱼是否具有保护作用及相关机制,为新生儿缺氧缺血性脑损伤开拓治疗思路,并探索不同浓度对干预效果的影响,为进一步的临床实验提供实验动物水平的研究资料,以期为临床研究提供实验室基础。[研究方法]1.动物模型的分组与建立同一批次野生型斑马鱼卵受精后5天(dpf),缺氧实验前随机分为正常对照组、H/R组(hypoxia/reoxygen,系统水复氧)、处理组(缺氧-医用臭氧复氧组),其中处理组根据臭氧浓度不同分为：0.05ppm、0.1ppm、0.2ppm三个亚组。均匀向密闭水箱中充入高纯氮气,溶氧仪监测氧浓度,当水中溶解氧低于0.5mg/L时,将H/R组和各处理组幼鱼放入缺氧装置中,建立斑马鱼幼鱼缺氧脑损伤模型。到达实验终点,即幼鱼沉底静止不动达1min,身体弯曲或抽搐,将幼鱼捞出,分别放入系统水和医用臭氧中进行复苏,以缺氧/复氧后3h为观察时间点。正常对照组水中溶解氧浓度在7.5mg/L左右。2.各项指标的检测方法2.1 幼鱼的一般状况复苏期间计时各组幼鱼苏醒时间,显微镜下观察缺氧/复氧后3h幼鱼心率变化、运动能力、生存分析等指标，初步评估缺氧/复氧对幼鱼生存状态的影响及医用臭氧对幼鱼的影响。2.2脑组织病理变化显微镜下观察TUNEL染色脑组织细胞凋亡变化。2.3脑组织氧化应激反应指标测定各组斑马鱼幼鱼缺氧/复氧后3h脑组织SOD、MDA、总抗氧化水平氧化应激指标。2.4脑组织SODmRNA表达水平利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析幼鱼缺氧/复氧后3h脑组织SODmRNA表达水平。3.统计方法对检测所得的数据进行统计描述,正态分布计量资料用均值±标准差(x±s)表示,结果用spss20.0统计软件进行分析；两组间均数比较采用两独立样本t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析,其中方差齐者用LSD法,方差不齐者用Dunnett's法进行分析。Kaplan-Meier法用于估计生存函数。P0.05为差异有统计学意义。应用Graphpad Prism 5.0作图软件进行数据的图片处理。[结果]1.动物一般状况正常组斑马鱼幼鱼一般状况良好,心率平稳,运动能力正常。缺氧/复氧后3hH/R组幼鱼运动能力减弱,游程缩短,出现抽搐、静止不动等表现。缺氧/复氧后3h内各组幼鱼(H/R组、0.05ppm-臭氧组、0.1ppm臭氧组、0.2-ppm臭氧组)平均苏醒时间分别为：37.5±6.1 min、 33.0±3.8mm、32.5±5.0min、32.6±5.6min,其中H/R组幼鱼平均苏醒时间最长,差异有显著性。与正常对照组同一时间点相比,0.1ppm复氧组幼鱼心率和H/R幼鱼平均心率稍慢,但差异无明显差异,0.05ppm复氧组和0.2ppm复氧组幼鱼心率加快,但差异无显著性。缺氧后14天内,正常对照组、H/R及各处理组(0.05ppm、0.1ppm、0.2ppm)幼鱼中位生存时间分别为12.87天,7.67天,9.96天,10.35天,8.96天；总体生存率差异有显著性(P0.001)。2.各组斑马鱼幼鱼脑组织TUNEL染色H/R和处理组幼鱼脑组织TUNEL染色阳性细胞的核呈斑点状棕褐色深染,形态不规则,大小不一,呈颗粒状分布于核周或浓缩成团,另有少数细胞核呈均匀黄色淡然,TUNEL染色阳性细胞散在分布于正常细胞之间,越靠近中心区域越明显。0.05ppm臭氧水复氧组和0.2ppm臭氧水复氧组细胞凋亡指数与H/R无明显差异,0.1ppm臭氧水复氧组凋亡细胞指数明显低于H/R,差异有统计学意义(P0.05)。3.各组斑马鱼幼鱼脑组织氧化应激反应指标3.1各组幼鱼脑组织总抗氧化水平变化与正常对照组相比,H/R组3h总抗氧化能力下降,差异无显著性(P0.05),而处理组总抗氧化能力升高(P0.05),其中0.1ppm组上升最明显。3.2各组幼鱼脑组织SOD水平变化与正常对照组相比,H/R组3h SOD活力降低(P0.05),处理组SOD活力增加(P0.05),其中0.1ppm组上升最明显。3.3各组幼鱼脑组织MDA水平变化与正常对照组相比,H/R组MDA含量在3h时升高(P0.05),处理组MDA含量也升高,但与H/R组无显著差异(P0.05)。4.各组幼鱼脑组织SODmRNA表达水平变化与正常对照组相比,H/R组在3h时SOD表达下调(P0.05),各处理组在3h时SOD表达明显上调(P0.05)。[结论]1.将斑马鱼幼鱼置于极低氧浓度环境中可建立斑马鱼幼鱼缺氧性脑损伤模型。2.缺氧可通过氧化应激损伤斑马鱼脑组织,氧化应激是斑马鱼缺氧性脑损伤的机制之一。3.医用臭氧对缺氧性脑损伤的脑组织氧化应激有抑制作用,可提高脑组织抗氧化水平,降低缺氧后脑细胞凋亡,提示医用臭氧对缺氧性脑损伤的斑马鱼幼鱼脑损伤有保护作用。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R722.1

【参考文献】

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1 许秀珍,朱天才;神经节苷脂对脑性瘫痪患儿神经功能的修复:2230例效果分析[J];中国临床康复;2005年07期

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本文编号：1142291