脆性X综合征相关蛋白FMRP多个亚型的鉴定及其功能研究

发布时间：2017-11-26 02:01

  本文关键词：脆性X综合征相关蛋白FMRP多个亚型的鉴定及其功能研究

  更多相关文章： 脆性X智力低下蛋白（FMRP） 选择性剪接 亚型

【摘要】：脆性X综合征（Fragile X syndrome, FXS）是引起遗传性智力低下的常见疾病之一。FMR1基因三核苷酸重复序列不稳定扩增导致脆性X智力低下蛋白（Fragile X mental retardation protein，，FMRP）表达的转录沉默是导致FXS的重要原因。已知FMRP的功能实现与其自身结构域的功能和结构密切相关。FMR1在多个物种都存在基因mRNA转录本的选择性剪接，形成不同的转录本及蛋白亚型（isoform）。不同的FMRP亚型蛋白可能导致在表达和功能上的重要差异。mFMRP的主要亚型（isoform1）由17个外显子编码产生，其它的亚型与之相比均存在不同程度的外显子序列缺失。最新研究鉴定了mFmr1的12种不同的转录本亚型；但目前为止大约有4-5种mFMRP亚型蛋白被鉴定出来。因为目前还没有蛋白亚型特异性抗体，造成对亚型蛋白的具体功能知之甚少。 本研究采用RT-PCR结合测序的实验方法，鉴定FVB近交系小鼠的胚胎鼠（E18）和成年鼠（P28）脑组织中mFmr1转录本亚型，比较各个亚型的使用频率。然后采用生物信息学软件预测这些转录本的开放阅读框（ORF），分析各个亚型蛋白序列的差异。构建体外表达包含V5标签融合亚型蛋白的质粒，并通过蛋白印迹（Western Blotting）实验分析各亚型在N1E-115、Neuro-2A、HEK-293细胞系中的分布情况，观察不同亚型结构对其自身分布的影响。从而探索mFMRP的潜在功能和调控机制。 我们发现：1、在E18小鼠和P28小鼠全脑组织存在5种序列选择性剪接模式，对选择性剪接的发生位点选择均符合GT-AG法则，形成了7种不同的mFmr1转录本亚型。2、mFmr1转录本亚型的分布具有发育时期特异性，在神经发育的不同阶段可能存在不同的优势类型，使得FMRP与RNA序列的识别和结合功能发生相应变化，以适应不同生长发育时期的特殊需要。3、同种mFMRP亚型蛋白在不同类型细胞系中的表达存在差异，在同一细胞系中不同亚型蛋白的分布也存在差异，提示不同的亚型蛋白因结构的差异可使其表达和分布产生差异，影响功能表达。4、V5标签蛋白在融合蛋白的位置（N-端或C-端）不同影响亚型蛋白的表达和分布。 本研究鉴定了从小鼠脑组织中分离出的7个mFmr1转录本亚型，其中Isoform6为首次发现的亚型，并证实FMRP亚型蛋白在不同细胞系中的表达及分布存在差异，推测在NLS结构域上可能存在关键的氨基酸残基位点，可能影响FMRP的转运入核功能。本研究为进一步探索mFMRP亚型的具体分布规律和翻译调控机制提供了一定的基础。
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R749.94

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