腺病毒介导的心肌营养素-1 对大鼠骨髓间充质干细胞向神经方向分化及存活的作用

发布时间：2018-02-22 19:29

本文关键词： 心肌营养素-1(CT-1) 骨髓间充质干细胞(BMSCs) 腺病毒神经分化凋亡存活　出处：《遵义医学院》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs), Adv-EGFP-CT-1(重组心肌营养素-1腺病毒)转染rBMSCs,观察CT-1对rBMSCs向神经方向分化的作用及对其存活的影响。方法：(1)培养及鉴定rBMSCs:全骨髓贴壁筛选法分离培养rBMSCs,流式细胞术鉴定细胞表面标记性蛋白。(2)Adv-EGFP-CT-1转染rBMSCs:将Adv-EGFP-CT-1分别以感染复数(MOI)为100、200、300、400PFU/细胞转染rBMSCs,于转染后24h、48h、72h、96h在荧光显微镜下观察转染率,流式细胞术鉴定其最佳MOI及最佳时间点(荧光显微镜下观察所得)转染率。同时于转染后24h、48h、3d、10d应用Real-timePCR检测转染后rBMSCs表达CT-1mRNA的情况、应用细胞免疫荧光检测转染后rBMSCs表达CT-1目的蛋白的情况,确定CT-1蛋白表达最强的时间点。(3)观察CT-1对rBMSCs向神经方向分化的作用：将rBMSCs分为以下4组：对照组、Adv-EGFP(重组腺病毒增强型绿色荧光蛋白)转染组(Adv-EGFP转染rBMSCs, MOI为200PFU/细胞)、Adv-EGFP-CT-1转染组(Adv-EGFP-CT-1转染rBMSCs, MOI为200PFU/细胞)及诱导剂组。除对照组外,其他各组均予神经分化诱导,于诱导后5h、3d、7d观察各组细胞形态学变化、细胞免疫荧光检测各组Nestin、NeuN、GFAP的表达。(4)观察CT-1对rBMSCs神经分化过程中细胞存活的影响：于诱导后5h、24h、48h DAPI染色法观察凋亡细胞核形态；流式细胞术检测细胞的早期凋亡率；于诱导后5h、3d、7d台盼蓝染色法检测细胞存活率。结果：(1) rBMSCs的培养及鉴定。rBMSCs原代细胞7天左右可以传代,第三代(P3)得到纯化,流式细胞术鉴定CD29、CD90、CD45的阳性率分别是99.27%、93.43%、1.46%。(2)Adv-EGFP-CT-1的转染率。其转染率随MOI及时间的改变而变化,MOI为200PFU/细胞、转染后48h达高峰(转染率为87.05%±0.95%)；Adv-EGFP-CT-1转染rBMSCs后CT-1mRNA的表达：转染后24hCT-1mRNA的相对表达量(423.42±11.61)均高于其他时间点(48h、3d、10d),差异有统计学意义(P0.05),48h、3d、10d之间差异无统计学意义(P0.05)；Adv-EGFP-CT-1转染rBMSCs后CT-1目的蛋白的表达：转染后48h,CT-1荧光强度达到最强(11.44±1.44),与24h相比差异有统计学意义(P0.05),与3d、10d相比荧光强度差异无统计学意义(P0.05)。(3)CT-1对rBMSCs向神经方向分化的作用。诱导处理后,除对照组外,其他各组均显示类神经细胞样形态改变,其中CT-1组此变化最明显；诱导后5hNestin的阳性率最高,其中CT-1组的阳性率均高于其他各组(86.31%±4.27%),差异有统计学意义(P0.05)；诱导后5h CT-1组NeuN、GFAP即有少量表达,随后NeuN、GFAP阳性率逐渐升高,至第7d时阳性率最高,其中,CT-1组各时间点NeuN、GFAP阳性率均高于其他各组,差异有统计学意义(P0.05)。(4)CT-1对rBMSCs神经分化过程中细胞存活的影响。CT-1组及对照组,细胞核大部分为淡蓝色圆形或椭圆形,而空病毒组及诱导剂组出现较多凋亡细胞核；诱导后各时间点,CT-1组及对照组早期凋亡率较空病毒组及诱导剂组明显减少,差异有统计学意义(P0.05)；诱导后不同时间点,CT-1组及对照组存活率均高于空病毒组及诱导剂组,差异有统计学意义(P0.05)。结论：(1)全骨髓贴壁筛选法可以获得纯化的rBMSCs;(2) Adv-EGFP-CT-1可以有效地转染rBMSCs, CT-1可在rBMSCs中高效长期表达；(3)CT-1可以促进rBMSCs向神经方向分化；(4)CT-1修饰的rBMSCs,联合神经诱导剂,为rBMSCs向神经方向分化提供可行的诱导方法；(5)CT-1可以维持rBMSCs神经分化过程中细胞的存活。
[Abstract]:Objective : To observe the effect of CT - 1 on neural differentiation and its survival in vitro . Methods : ( 1 ) To investigate the effect of CT - 1 on the expression of CT - 1 mRNA and to determine the expression of CT - 1 mRNA . The expression of CT - 1 mRNA was observed at 24 h , 48 h , 72 h and 96 h after transfection . Results : ( 1 ) The expression of CT - 1 mRNA was higher in CT - 1 group than in other groups ( P0.05 ) . The positive rate of CT - 1 mRNA was higher than that in other groups ( P0.05 ) . ( 4 ) The effect of CT - 1 on the survival of the cells in the course of neurodifferentiation of rMSCs . The majority of the nuclei in CT - 1 group and the control group were pale blue circle or oval , while the empty virions and the inducing agent group appeared more apoptotic nuclei . After induction , the early apoptosis rate of CT - 1 and control group were significantly decreased ( P0.05 ) ; the survival rates of CT - 1 and control groups were higher than those of the empty virus group and the inducer group after induction ( P0.05 ) . Conclusion : ( 1 ) The recombinant rMSCs can be efficiently transfected by the whole marrow adherent screening method ; ( 2 ) the high - efficiency and long - term expression of rMSCs can be promoted by CT - 1 . ( 3 ) CT - 1 can promote the differentiation of rMSCs into the neural direction ; ( 4 ) CT - 1 modified rMSCs and combined nerve inducing agents provide a feasible induction method for the differentiation of rMSCs into the neural direction ; and ( 5 ) CT - 1 can maintain the survival of the cells during the neurodifferentiation of rMSCs .

【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：

【参考文献】