未成熟兔肺缺血再灌注损伤及亚细亚酸保护作用和机制的研究

发布时间：2018-02-27 06:19

本文关键词： 婴幼儿缺血再灌注损伤肺保护线粒体亚细亚酸　出处：《复旦大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：体外循环(Cardiopulmonary bypass, CPB)技术是心内直视手术的保证和前提,目前心肌保护技术接近成熟,围术期心血管事件已大大减少。而非心血管并发症如肺损伤的发生不仅没有减少,反而逐渐成为影响CPB术后恢复的主要因素。CPB术后急性肺损伤的发生率却高达15-30%,CPB相关性肺损伤仍是一个不容忽视的问题。肺脏是在CPB过程中除心脏之外唯一未被正常灌注和得不到有效降温的器官；同时肺脏又是直接与外界相通的脏器,易致损伤后的继发感染；通常认为,肺脏起着血液循环“滤过器”的作用,又易受到炎症细胞、炎性介质和各种微血栓等毒性物质的损害。所以,肺脏是除心脏之外最易遭受再灌注损伤的器官。相对于成人病例的成熟肺脏,儿童病例的肺脏,特别是新生儿、婴幼儿的肺脏发育尚未成熟,更容易受到伤害。据报道,我国每年新出生婴儿中先心病患者可达18万-22万,目前先心病的治疗原则是早期一期根治,恢复其正常的血流动力学,为术后重要脏器的发育提供最基本的前提条件和保障。所以会有越来越多的先心病患儿在婴幼儿期或新生儿期进行心内直视手术。由于婴幼儿肺脏不同于成人的独特解剖和病理生理特点,而且未成熟肺在CPB中的保护措施仍不完善,CPB术后急性肺损伤的发生率和损伤严重程度远高于成熟肺脏,已构成了婴幼儿、新生儿心脏术后恢复的最大障碍,严重制约着新生儿、婴幼儿心脏手术的开展。因此,如何提高婴幼儿围术期肺功能的保护水平对提高其手术成功率至关重要,是一个需要亟待解决的问题。 CPB后急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是缺血再灌注过程中直接引发的,当CPB转流开始后,肺脏处于相对高温、高氧耗、高代谢状态,即缺血、缺氧状态,在肺动脉恢复灌注后,大量氧和血进入肺脏,氧自由基、炎症因子、细胞酶类在肺内大量产生,导致肺血管内皮细胞广泛受损,通透性增加,最终导致肺缺血/再灌注损伤。目前多数研究认为肺缺血再灌注损伤和全身炎症反应是CPB相关性肺损伤的最主要的发生机制。所以,如何减轻肺缺血再灌注损伤,减轻炎症反应是解决CPB相关性肺损伤的关键所在。研究认为,缺血再灌注导致ROS的过度释放,并由此引起的氧化应激、线粒体功能下降是缺血再灌注肺损伤的主要病理机制。在心脏直视手术过程中,多种因素可诱发单核巨噬细胞、内皮细胞等释放大量前炎性细胞因子。研究显示在大量前炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-8及ROS等通过炎性细胞表面Toll-like受体将刺激信号传递到胞浆后,髓核细胞分化因子MyD88在调控其下游的炎症信号分子表达中起着非常关键的作用；并直接影响到靶组织中炎症细胞的进一步活化和趋化及靶组织中炎症反应的程度。亚细亚酸(asiatic acid, AA),是积雪草提取物中的五环三菇烯类组分。根据文献报道,它有三种功能相关结构：三个轻基,一个不饱和键和一个竣基。AA的药理作用包括：(1)抗炎作用其机制可能与促进线粒体Cytc的释放,激活caspase3,切割Poly聚合酶,选择性诱导巨噬细胞凋亡有关。(2)抗损伤作用细胞内的线粒体曾被誉为真核细胞的“动力站”。线粒体除提供ATP、生成活性氧(ROS)、参与细胞氧化还原信号转导等,还调控细胞凋亡,甚至被誉为“细胞死亡的开关”,在正常组织细胞的保护和癌细胞凋亡的诱导中均发挥重要作用。Gao等认为亚细亚酸可以清除超氧负离子和羟基,剂量依赖性抑制钙离子诱导的线粒体溶胀而保护肝线粒体。以上理论为临床婴幼儿未成熟肺损伤与保护的研究提供了理论基础,国内外尚未见亚细亚酸对婴幼儿未成熟肺保护作用的报道。我们设想通过建立未成熟兔肺缺血再灌注模型,观察其缺血再灌注损伤后的变化,进一步研究其机制；再针对其损伤发生机制,观察应用亚细亚酸是否可以减轻未成熟兔肺缺血再灌注损伤,达到一定的肺保护作用,以此来探讨一种新的针对婴幼儿未成熟肺损伤的保护方法,对于改善婴幼儿先心病外科治疗效果具有十分重要的意义。第一部分缺血再灌注损伤对未成熟兔肺的影响目的：通过婴幼儿兔和成年兔肺缺血再灌注损伤的对比,研究婴幼儿兔未成熟肺损伤的特点及其可能的机制。方法：选用成年(5～6月)和婴幼儿(15～21天)新西兰白兔各24只,随机配对分组：成年Sham组、成年IR组、婴幼儿Sham组、婴幼儿IR组。建立单肺缺血再灌注模型,肺门血管阻断1h,开放再灌注4h。术毕收集肺组织,光镜和电镜观察其组织病理和超微结构改变；提取肺组织中的线粒体,行膜电位(△ψ m)、肿胀率及游离钙水平测定；测定肺组织MDA, ROS-HR浓度及SOD, GSH-PX活性；Western Blot检测MyD88和NF-κB水平；收集各时间点的血样,ELISA法检测IL-1β、TNF-a水平。结果：未成熟肺组织缺血再灌注后损伤明显。与成年IR组相比,婴幼儿IR组兔肺组织有更多的白细胞侵润,肺泡细胞与间隔组织肿胀明显,肺泡腔内有较多的渗液,部分肺泡腔塌陷；出血多见；超微结构改变明显,部分肺泡上皮细胞及内皮细胞脱落,线粒体肿胀明显,嵴破裂,甚至消失。婴幼儿IR组线粒体膜电位下降明显,游离钙浓度明显升高；MDA, ROS-HR浓度升高明显；SOD,GSH-PX活性下降；各时点的IL-1β、TNF-a水平也有不同程度升高,特别是再灌注后的2h、4h,(P0.01)；肺组织中MyD88和NF-κB表达也显著升高。婴幼儿IR组和成年IR组之间的差异有显著的统计学意义(P0.01)。结论：缺血再灌注可导致急性肺损伤；与成熟肺相比,婴幼儿未成熟肺损伤更为严重。这可能与婴幼儿产生更多的ROS,相对低的抗氧化能力和炎性反应严重有关。第二部分亚细亚酸对未成熟兔肺缺血再灌注损伤的保护作用目的：观察亚细亚酸(Asiatic acid, AA)对婴幼儿未成熟肺缺血再灌注损伤的保护作用,探讨亚细亚酸清除氧自由基,减轻线粒体损伤,保护肺功能的机制。方法：选用婴幼儿(15～21天)新西兰白兔各60只,随机分配到Sham组、IR组、亚细亚酸低剂量、中剂量和高剂量组。建立单肺缺血再灌注模型,肺门阻断1h后,开放再灌注4h。亚细亚酸按7.5mg/kg、15mg/kg和30mg/kg三种剂量术前三天给予。术毕收集肺组织,光镜和电镜观察其组织病理和超微结构改变；提取肺组织中的线粒体,行线粒体膜电位(△ψ m)、肿胀率及游离钙水平测定；测定肺组织MDA, ROS-HR浓度及SOD,GSH-PX活性；Western Blot检测MyD88和NF-κB水平；收集各时间点的血样,ELISA法检测IL-1β、TNF-a水平。结果：亚细亚酸干预组肺缺血再灌注损伤明显减轻。光镜观察,亚细亚酸预处理组肺泡与肺泡间隔肿胀程度明显轻于缺血再灌注组,肺泡腔渗液减少,出血少见。电镜观察,肺泡上皮与血管内皮细胞脱落明显减少,线粒体形态趋于正常,肿胀减轻,嵴破裂少。亚细亚酸预处理,明显抑制缺血再灌注损伤所致的线粒体膜电位(△ψm)的下降,线粒体的肿胀明显减轻,与电镜观察下的肺超微结构改变一致。肺组织中MDA, ROS-HR浓度明显降低,SOD及GSH-PX活性明显升高；各时点的IL-1β、TNF-a水平也有不同程度下降,特别是再灌注后的2h、4h,(P0.01)；肺组织中MyD88和NF-κB表达也显著下降。亚细亚酸干预组的生存率(66.7%～75%)明显高于缺血再灌注损伤组(50%),三种剂量干预组的各项指标和IR组相比,均有好转,指标之间的差异有统计学意义(P0.05)或显著的统计学意义(P0.01),其中,中等剂量组的保护效果最好。结论：亚细亚酸对婴幼儿未成熟肺缺血再灌注损伤有一定的保护作用,其机制与清除氧自由基,减轻线粒体损伤和减轻全身炎性反应有关。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R725.6

【参考文献】