Cx43及Cx43-hemichannel在大鼠全脑缺血再灌注损伤中的作用

发布时间：2018-03-08 00:36

  本文选题：缝隙连接　切入点：缝隙连接蛋白43　出处：《山东大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景 脑血管病(cerebrovascular disease, CVD)以突发性神经系统功能障碍为特点,临床多表现为急性偏瘫、失语、惊厥、意识障碍、颅内压增高等,是导致人类死亡的三大主要疾病之一。根据病理特点,可分为缺血性和出血性两大类,其中缺血性占绝大多数。临床上,脑梗死、心肌梗死、休克、新生儿窒息、新生儿缺氧缺血性脑病、脑外伤等都可引起脑缺血性损害。对脑缺血的研究目前有成熟的体内、体外模型,体内模型有全脑缺血模型和局灶性脑缺血模型,体外模型主要为单纯缺氧模型和氧糖剥夺模型,但各模型都无法完全模拟人类复杂的脑缺血病理过程。目前对缺血性脑血管病的研究主要集中在再灌注损伤对最终梗死灶体积的影响方面,普遍认为再灌注损伤以细胞凋亡为主。对神经细胞凋亡的研究中大多以神经元为主,而对数量庞大、作用广泛的神经胶质细胞涉及很少。 半胱氨酸天冬酶3(Cysteinyl aspartate-specific protease-3, Caspase-3)是目前研究较多和比较明确的一种凋亡因子,是细胞凋亡级联反应下游最关键的蛋白酶,是各种因素启动的凋亡程序的必经之路。多项研究发现脑损伤后星形胶质细胞可表达Caspase-3,其表达量与凋亡指数呈正比,提示Caspase-3亦与神经胶质细胞凋亡有关。 缝隙连接(gap junction, GJ)是相邻细胞间的跨膜通道,由相邻细胞膜上的两个半通道(hemichannels)相互锚定组成。缝隙连接蛋白(connexin, Cx)是这两种通道的结构蛋白,Cx43是Cx家族中数量最为丰富的成员,且已证实Cx43在人及大鼠的神经胶质细胞中存在。缝隙连接能在细胞间传输毒性代谢产物和能量,其可能对脑损伤的扩散或修复有影响。已发现使用缝隙连接阻断剂可减轻脑缺血或缺血再灌注引起的脑损伤,减小梗死面积。但从基因方面抑制缝隙连接形成反而使细胞或组织更易受损。因此,缝隙连接对脑损伤是否起保护作用仍存在争论,可能与缝隙连接阻断剂缺乏特异性有关。近来发现细胞膜上未配对的半通道是可以单独存在的,并在许多病理生理情况下开放,其开放可致细胞凋亡及脑损伤加重。越来越多研究证明缝隙连接及半通道与创伤愈合、心肌梗死、心律失常、脑梗死、癫痫、肿瘤等都有密切关系。缝隙连接蛋白(Cx)的研究主要集中在线粒体、细胞核中的Cx对细胞死亡及增殖的抑制,相关机制仍不十分明确。 既然缝隙连接、半通道都与脑损伤相关,二者的结构基础Cx又与细胞死亡有关,而神经胶质细胞的存亡决定脑损伤的预后,我们考虑可以从Cx、缝隙连接及半通道入手,研究三者对神经胶质细胞凋亡的影响及在缺血再灌注损伤中的作用。因此,我们选择大鼠全脑缺血再灌注模型,检测再灌注期间Caspase-3、Cx43及Cx43-hemichannel (Cx43-hcl)蛋白的表达变化(其中对Cx43-hemi channel表达的检测国内鲜有报道),证明Cx43及Cx43-hemichannel可能通过促进神经胶质细胞凋亡而参与脑缺血再灌注损伤,为缺血性脑血管病的临床治疗提供新的理论依据。 目的 研究大鼠全脑缺血再灌注损伤致半胱氨酸天冬酶3(Caspase-3)、缝隙连接蛋白43(Connexin43, Cx43)及其半通道蛋白(Cx43-hemichannel)的表达变化,探讨Cx43及Cx43-hemichannel在脑缺血再灌注损伤中的作用,为脑缺血的治疗寻找新的理论基础和治疗手段。 方法 健康成年雄性Wistar大鼠56只(造模失败后补充动物),体重270-320g,随机分为假手术组(Sham组)、全脑缺血10min再灌注0.5h组(IR/0.5h组)、全脑缺血10min再灌注6h组(IR/6h组)、全脑缺血10min再灌注24h组(IR/24h组),每组14只动物,8只用于免疫荧光组化,6只用于免疫印迹(Western blot)。采用改良的Pulsinelli四血管闭塞法(4-VO)制作大鼠全脑缺血再灌注模型,各组大鼠在预定时间点断头取脑,分别采用免疫荧光组织化学方法和免疫印迹方法检测各组大鼠侧脑室室下区(the subventricular zone, SVZ) Caspase-3、Cx43和Cx43-hemi channel的表达变化。 结果 1动物模型制备56只成年雄性Wistar大鼠中全脑缺血再灌注模型制备成功47只(造模失败后补充动物),成功率84%,9只造模失败的大鼠中死亡4只(麻醉意外2只,手术过程中出现误吸1只,分离颈总动脉时造成大出血1只),不符合模型标准5只(未出现瞳孔变大3只,术中或术后出现惊厥样抽搐2只)； 2免疫荧光组织化学方法显示假手术组见极少量Caspase-3阳性表达,少量Cx43和Cx43-hemichannel阳性表达,在全脑缺血10min再灌注0.5h时各蛋白阳性表达开始增加,但与假手术组比较差异均无统计学意义(P0.05),于再灌注6h和24h时各蛋白阳性表达明显增加,以24小时为著,与假手术组比较差异均有统计学意义(P0.05)； 3免疫印迹法显示Caspase-3、Cx43和Cx43-hemichannel蛋白表达于全脑缺血10min再灌注0.5h时开始升高,但与假手术组比较差异均无统计学意义(P0.05),于再灌注6h和24h时各蛋白阳性表达明显增加,以24小时为著,与假手术组比较差异均有统计学意义(P0.05)。 结论 脑缺血再灌注损伤可致神经胶质细胞发生凋亡,Cx43及Cx43-hemichannel在神经胶质细胞凋亡过程中起到了促进作用,可能是缺血再灌注损伤发生及发展的机制之一。 意义 初步证明,Cx43及Cx43-hemichannel的上调可致神经胶质细胞凋亡增多,是脑缺血再灌注损伤发生与发展机制之一,从而为缺血性脑血管病的治疗及新药的开发提供了一种新的思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R748

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本文编号：1581688