α7nAChR功能状态在调控肥胖时促酰化蛋白抵抗中的作用及具体机制

发布时间：2018-03-08 13:08

本文选题：α7型烟碱样乙酰胆碱受体　切入点：非神经元型胆碱能系统　出处：《郑州大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景及目的二十世纪90年代至今,科技的进步和经济的飞速发展,生产力得到极大的提高,生活方式的改变,肥胖发生率在全球范围内逐渐增高。肥胖以脂肪细胞体积增大、甘油三脂数量增多和慢性低度炎症为特征,成为人类的健康杀手。脂肪组织不仅以甘油三脂的形式储存能量,而且和其他内分泌器官一样具有内分泌功能,大量分泌促酰化蛋白(acylation stimulating protein,ASP)、瘦素、脂联素等,该类物质统称为脂肪因子。研究发现,脂肪因子具有调节糖、脂代谢和胰岛素的敏感性等功能,与机体胰岛素抵抗、中心性肥胖等相关。促酰化蛋白(ASP)是近来备受关注的脂肪因子,它是由补体C3和因子B、因子D作用,分裂成C3a,然后C3a分裂产生C3adesArg(即ASP)。C5L2是ASP的受体,表达于脂肪、肝脏、骨骼肌、肾脏等组织。在脂肪细胞,ASP直接与C5L2结合,激活PLCβ,促进PKCα和PKCζ磷酸化蛋白的表达,提高DGAT的活性和促进GLUT4易位,通过PLC以及PI3K-AKT,参与促酰化蛋白介导的甘油三酯的合成。肥胖时,脂肪细胞合成甘油三酯的能力有限,未形成甘油三酯的脂肪酸从脂肪组织游离,并沉积于骨骼肌、肝脏等组织,导致靶器官的胰岛素敏感性降低;高浓度的游离脂肪酸(FFA)诱发血脂紊乱并具有脂毒性,促进炎症形成;脂肪因子功能发生转化,激活补体系统,促进脂肪因子ASP大量产生,降低C5L2的表达、ASP和C5L2的结合率等环节,导致肥胖机体出现促酰化蛋白抵抗(ASP resistance),同时存在瘦素(leptin resistance)抵抗和胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)等,出现以血脂紊乱、心血管疾病、中心性肥胖、2型糖尿病为症候群的代谢综合征(MS)。非神经元型胆碱能系统(non-neuronal acetylcholinergic system,NNAs)是一类存在于脂肪细胞,内皮细胞等多种非神经元细胞和组织中的胆碱能系统。非神经元型胆碱能系统通过递质乙酰胆碱与靶细胞上的胆碱能受体结合,参与调节细胞因子和激素的信息交流、细胞及周围微环境的信号传递,广泛调控体内生理、病理过程。脂肪组织通过自分泌和(或)旁分泌等方式分泌脂肪因子,并且脂肪因子与各组织、系统形成交互网络,参与糖、脂代谢,免疫功能等。活化非神经元型胆碱能系统可以改善胰岛素敏感性,该作用与调控脂肪因子的表达密切相关。大量的研究发现尼古丁长期暴露使正常啮齿类动物和吸烟者的体重较无尼古丁暴露者体重低,并且戒烟后体重增加;Liu等发现尼古丁通过长期刺激nAChRs调节脂肪因子的释放,进而增加胰岛素的敏感性;研究发现活化的α7型烟碱样乙酰胆碱受体(α7nAChR)具有控制机体炎症、降低体重、改善胰岛素敏感性和调节细胞因子分泌等重要的功能;而缺乏α7nAChR,尼古丁刺激不能降低机体体重和改善胰岛素抵抗,由此可知,α7nAChR在调控代谢参数方面具有举足轻重的作用。研究α7nAChR介导的非神经元型胆碱能系统的活化在抑制ASP-C5L2信号通路促成脂作用,可为防治饮食源性肥胖提供新的视角。本文通过体内实验和体外实验主要研究α7 nAChR的功能状态在调控ASP-C5L2信号通路合成甘油三酯的分子机制。在体内实验,高脂饮食(HFD)诱导的肥胖模型小鼠接受尼古丁或(和)甲基牛扁亭碱或氧化六烃季铵注射3周,检测不同组小鼠体重、血糖、血TG、血ASP水平,检测C5L2 m RNA在不同组小鼠脂肪组织、肝脏、骨骼肌、肾脏等组织表达的影响;检测α7nAChR蛋白在HFD小鼠和LFD小鼠脂肪组织表达的水平;在体外实验,对脂肪组织给予PNU282987预处理24小时和(或)渥曼青霉素(Wortmannin)预处理30分钟,检测活化α7nAChR介导的非神经元型胆碱能系统的活化对ASP诱导的AKT/PKB Ser 473磷酸化水平的影响。研究α7nAChR的功能状态影响ASP-C5L2信号下游通路甘油三酯的合成,从而为寻找以α7nAChR作为治疗肥胖以及肥胖相关并发症的一个新的靶点提供理论依据。方法1.C57BL/6J雄性小鼠(5-6W龄)随机分为高脂饮食组(HFD组)和低脂饮食组(LFD组)。HFD组给予高脂饮食(D12492配方)、LFD组给予普通饮食,饲养16周-18周,期间间断补充蛋黄、葵花籽等高蛋白食物。每天观察小鼠的精神状态,饮食、大小便,活动、皮毛色泽,每周换垫料、刷洗笼子、称重并记录。2.喂养12周后的各组小鼠接受药物注射。HFD组和LFD组分别分为4组:盐水(NS)组、尼古丁(NIC)组、尼古丁和甲基牛扁亭碱(NIC+MLA)组、尼古丁和氧化六烃季铵(NIC+HEX)组。NS组:生理盐水10ml/kg/day,ip,Bid;NIC组:尼古丁1 mg/kg/day,ip,Bid;NIC+MLA组:甲基牛扁亭碱3 mg/kg/day,ip,Bid,尼古丁1 mg/kg/day,ip,Bid(甲基牛扁亭碱先于尼古丁30分钟注射);NIC+HEX组:氧化六烃季铵5 mg/kg/day,ip,Bid,尼古丁1 mg/kg/day,ip,Bid(氧化六烃季铵先于尼古丁30分钟注射)。给药时间:9:30,21:30。连续给药21d,并记录每天的体重。3.给药结束,各组小鼠在取材前相继接受腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT)和腹腔注射胰岛素耐量实验(IPITT),两个实验之间每组小鼠均有3天恢复期;经小鼠眼内眦静脉取血,分别采用ELISA法检测各组小鼠血促酰化蛋白(ASP)的水平、采用GPO-PAP法检测各组小鼠血甘油三脂(TG)的水平;取睾周脂肪组织、肝脏左外叶、肾脏、骨骼肌等组织,采用荧光定量PCR法检测C5L2mRNA在上述组织的表达水平。采用Western Blot检测α7nAChR在HFD小鼠和LFD小鼠脂肪组织表达情况。4.体外脂肪组织培养:脂肪组织分为4组,每组2个复孔。分为对照(PBS)组、酰化刺激蛋白(ASP)组、PNU282987+酰化刺激蛋白(PNU+ASP)组、PNU282987+渥曼青霉素+ASP(PNU+WOR+ASP)组。给予方法:ASP组:ASP 100nM/L,温箱孵育10分钟;PNU+ASP组:PNU28298710nM/L温箱孵育24h,弃旧培养基,添加1ml新鲜的培养基,ASP 100nM/L,温箱孵育10分钟;PNU+WOR+ASP组:渥曼青霉素200nM/L温箱孵育30分钟,弃旧培养基,添加1ml新鲜的培养基;PNU282987 10nM/L温箱孵育24h后,然后再次更换1ml新鲜培养基;添加ASP 100nM/L,温箱孵育10分钟。采用Western Blot检测各组AKT/PKB Ser 73磷酸化水平。5.采用SPSS17.0软件对各组实验数据进行统计学分析,数据采用`x±s表示。实验组和其对照组以及两比较组间使用t检验进行比较,P0.05为差异有统计学意义。结果1.HFD小鼠和LFD小鼠的体重随着喂养时间不断增加,在喂养前4周,HFD组和LFD组小鼠的体重相比,差异无统计学意义。在第8周,与LFD组小鼠体重相比较,HFD小鼠体重显著增加,差异有统计学意义(P0.0001)。2.在3周经腹腔注射药物始末,各组小鼠体重的增量比较:HFD小鼠NS组体重较LFD小鼠NS组体重显著增加(P0.05)。在HFD小鼠,NIC组小鼠体重较NS组小鼠体重明显降低(P0.001);NIC+MLA组(P0.05)以及NIC+HEX组(P0.001)体重较NIC组显著增加,NIC+MLA组小鼠体重较NIC+HEX组小鼠体重低(P0.05))。在LFD小鼠,NIC组体重较NS组降低(P0.05);NIC组与NIC+MLA组、NIC+HEX组小鼠体重,三组之间差异无统计学意义。3.各组血ASP和TG水平:HFD小鼠NS组血TG水平较LFD小鼠NS组明显增高(P0.05)。在HFD小鼠,NIC组血TG水平较NS组血TG水平明显降低(P0.05);NIC+MLA组、NIC+HEX组较NIC组血TG水平显著增高。在LFD小鼠,血TG水平在NS组、NIC组、NIC+MLA组、NIC+HEX组四组之间没有显著差异。HFD小鼠NS组血ASP水平较LFD小鼠NS组血ASP水平明显增高(P0.05)。在HFD小鼠,NIC组血ASP水平较NS组血ASP水平明显降低(P0.05);NIC组、NIC+MLA组和NIC+HEX组的血ASP水平,三组之间差异没有统计学意义。在LFD小鼠,血ASP水平在NS组、NIC组、NIC+MLA组、NIC+HEX组四组之间没有显著差异。4.血糖:与LFD NS组小鼠的空腹血糖相比较,HFD NS组小鼠的空腹血糖较高,差异有统计学意义(P0.05)。在HFD小鼠,NIC组小鼠的空腹血糖水平与NS组小鼠的空腹血糖相比较,NIC组小鼠的空腹血糖水平低(P0.05),差异有统计学意义;NIC组和NIC+MLA组、NIC+HEX组小鼠的空腹血糖,三组之间的空腹血糖水平差异没有统计学意义。在LFD小鼠,NIC组小鼠的空腹血糖水平与NS组小鼠的空腹血糖相比较,NIC组小鼠的空腹血糖水平低(P0.05),差异有统计学意义。与NIC组小鼠的空腹血糖水平比较,NIC+MLA组小鼠的空腹血糖(P0.001)与NIC+HEX组小鼠的空腹血糖(P0.01)均较高,差异有统计学意义。5.HFD小鼠NS组较LFD小鼠NS组具有较高的血葡萄糖水平,HFD小鼠NS组IPGTT曲线下面积更大;与NS相比,HFD小鼠和LFD小鼠的NIC组血葡萄糖水平低,NIC组具有明显改善的IPGTT曲线。在HFD小鼠,NIC+MLA组较NIC组具有较高的血葡萄糖水平。在LFD小鼠,NIC组、NIC+MLA组以及NIC+HEX组的糖耐量,三组之间差异没有统计学意义。HFD小鼠的糖耐量实验,与NS组小鼠的血葡萄糖相比,NIC组小鼠的血葡萄糖水平在注射胰岛素后30min,60min和90min显著降低,NIC组、NIC+MLA组和NIC+HEX组之间血葡萄糖水平随胰岛素注射后时间变化没有明显差异。6.与LFD小鼠AUC比较,HFD小鼠AUC显著增多(P0.01)。在HFD小鼠,NIC组AUC显著小于NS组(P0.01)。NIC组、NIC+MLA组和NIC+HEX组三者的AUC没有明显差异。在LFD小鼠,NIC组AUC小于NS组AUC(P0.05);NS组、NIC+MLA组和NIC+HEX组三者的AUC没有明显差异。7.C5L2mRNA在各组睾周脂肪组织、肝脏左外叶、肾脏、骨骼肌等组织的表达情况:与LFD小鼠NS组相比,HFD小鼠NS组C5L2mRNA在肝脏左外叶(P0.01)、脂肪组织(P0.001)、肾脏(P0.001)、骨骼肌组织(P0.05)表达均显著降低,差异有统计学意义。在HFD小鼠,与NS组相比,NIC组C5L2基因在脂肪组织(P0.05)、肌肉组织表达增高(P0.05),而在肝脏组织表达降低(P0.001);NIC+MLA组较NIC组C5L2基因在肝脏组织表达增加(P0.01)。在LFD小鼠,与NS组比较,NIC组C5L2基因在脂肪组织(P0.001)、肝脏(P0.001)、骨骼肌(P0.05)、肾脏(P0.001)表达降低;NIC+MLA组(P0.001)和NIC+HEX组(P0.01)较NIC组C5L2基因在肝脏组织表达较低。NIC+MLA组和NIC+HEX组与NIC组相比,C5L2基因在脂肪组织、肾脏组织、骨骼肌组织表达没有明显差异。8.α7nAChR蛋白在小鼠脂肪组织表达,并且α7nAChR蛋白在HFD小鼠脂肪组织表达水平较在LFD小鼠脂肪组织表达低(P=0.0379),差异有统计学意义。9.与PBS组相比,ASP组Akt蛋白的磷酸化水平显著增高(P=0.0379),且差异具有统计学意义。PNU282987预孵育24小时,降低了ASP(P=0.0292)诱导的Akt磷酸化水平。渥曼青霉素+PNU282987+ASP组与ASP组两组相比较,两组Akt蛋白的磷酸化水平差异没有统计学意义。结论α7nAChR介导的非神经元型烟碱样胆碱能系统的活化通过PI3K-AKT抑制ASP-C5L2下游信号通路促成酯作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R723.14

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