孤独症模型大鼠经典Wnt信号通路与氧化应激变化的研究

发布时间：2018-04-13 21:46

本文选题：孤独症 + 丙戊酸盐　；参考：《复旦大学》2012年博士论文

【摘要】：孤独症(autism)又称自闭症,是一种广泛的神经发育障碍性疾病,一般于3岁前发病,严重影响儿童的语言形成、情绪认知与社会行为。多数患儿有明显的语言交流艰难、社交行为障碍、重复刻板行为三大核心临床表现。这些患儿不能正常入托、上学,甚至将来也无法工作。近年来的统计数据资料表明,autism的发病率逐年增多。Autism的病因不明,目前普遍认为是遗传和环境因素在脑发育关键时期共同作用的结果。如,妊娠早期有丙戊酸盐(Valproic acid, VPA)用药史的产妇,其子代发生autism风险大大增加。非遗传因素可能与干扰胚胎脑发育的正常的信号通路传导有关,而遗传因素可能是信号通路传导异常导致的基因突变所致。 Wnt/β-catenin信号通路对个体发育,尤其是神经系统发育有重要的调控作用。在个体发育早期,它调控神经细胞的增殖、分化、凋亡与迁移以及突触的形成与联系,调控细胞、组织及器官正常有序的分化和生长发育。然而Wnt通路犹如双刃剑,既是调控神经细胞正常分化发育的重要通路,又是神经发育疾病发生的成因之一,通路中任何蛋白分子的异常,都将引起信号传递错误,导致细胞命运的改变,进而引发神经发育障碍疾病的发生,如autism。许多autism患者存在Wnt2编码序列基因突变,故Wnt2基因是autism易感基因。敲除通路中散乱蛋白(Dishevelled, Dvl)-1基因的小鼠,表现出社交行为和感觉运动障碍,说明Dvl-1基因可能参与动物社会行为的形成,这可能与Dvl-1调节神经发育有关,因为从Dvl-1敲除鼠组织培养的海马神经元树突发育异常。Dvl-1和Dvl-2缺失的小鼠,神经管闭合不全。β-catenin转基因小鼠,则能使神经前体细胞增殖,导致巨大脑、脑皮质容量增加,这可能与autism脑早期的过度增生有关。这些研究强烈提示Wnt通路与autism的发病密切相关。近年来,大量临床资料报道表明autism患者存在氧化应激的失调,如氧化应激生物标记物分泌增加,体内内源性抗氧化能力减少,能量代谢失调,线粒体功能障碍。Dickkopfl (Dkkl)是一种分泌性的Wnt抑制剂。研究显示,Dkk1转染能显著增加氧化应激产生的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平。Nucleoredoxin (NRX)作为一种氧化还原剂,通过与Dvl作用,对Wnt信号通路进行负调节。H202作用于细胞减少了NRX和Dvl的相互作用,导致T细胞因子(T cell factor, TCF)暂时激活。而与这些结果截然相反的许多研究显示,H202诱导ROS依赖性的信号转导抑制了β-catenin/TCF转录活性。ROS能抑制许多磷酸酶,而H202处理后GSK3怎么去磷酸化并不清楚。有趣的是,有研究显示,Dv1高表达能改善H202诱导的β-catenin/TCF转录活性抑制。因此,这些研究提示ROS依赖于Dvl在调节Wnt信号通路中起双重作用。这也说明氧化应激与Wnt信号通路之间存在关联。那么,autism动物模型是否存在氧化应激异常?在autism产生过程中氧化应激与Wnt信号通路是否存在关联?用Wnt信号通路特异性抑制剂是否能改善autism行为学异常?目前尚不清楚。针对这些问题,本课题集中研究autism动物模型及培养神经元中氧化应激与Wnt/β-catenin通路相关分子的关系,以探讨autism发病的相关分子机制。我们主要进行了以下三方面的工作：一、建立并检测了autism动物模型。采用Wistar大鼠,在妊娠第12.5天时,腹腔注射(Intraperitoneal injecting, ip) VPA制作子代autism大鼠模型,并运用热板致痛法、倾斜板实验、Morris水迷宫等方法对模型大鼠进行发育与行为学检测。结果显示,与正常对照组比较,autism模型组大鼠脑发育异常、睁眼时间推迟、方向趋向性机能及伤害性知觉下降、游泳能力差、重复刻板动作增加、学习记忆和空间探索能力差。这些表现与人类autism患者的某些特征极为相似,表明用VPA注射法较成功地制作出了autism大鼠模型。二、研究了Wnt/β-catenin信号通路及氧化应激水平。运用Real-time PCR和Western blot技术检测autism模型大鼠前额叶皮层(Prefrontal cortex, PFC)和海马(Hippocampus, HC)两脑区Wnt通路信号蛋白GSK-3p,磷酸化GSK-3β(Phosphorylated GSK-3β, P-GSK-3β), β-catenin,磷酸化β-catenin (Phosphorylated β-catenin, P-β-catenin)及氧化应激标记物4-羟壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE),硫氧还原蛋白(Thioredoxin, Trx)等相关分子的表达。进而我们检测了Wnt信号通路的特异性抑制剂Sulindac对氧化应激的影响。Western Blot结果显示,在autism模型大鼠PFC和HC脑区,Wnt通路关键信号蛋白失活的P-GSK-3β上调,抑制性的P-β-catenin下调,差异显著高于对照组(P0.001)。同时,氧化应激标记物4-HNE表达增加(P0.01),Trx表达减少(P0.05)。Real-time PCR结果显示,autism模型组大鼠PFC和HC脑组织GSK-3βmRNA水平显著低于对照组(P0.05),而β-catenin mRNA水平显著高于对照组(P0.01)。同时,抗氧化基因trx1,trx2mRNA表达下调(P0.05)。Wnt信号通路的特异性抑制剂Sulindac作用以后,与autism模型大鼠相比,VPA+Sulindac处理组失活的P-GSK-3p下调(P0.05),抑制性的P-β-catenin上调(P0.05),而氧化应激标记物4-HNE减少(P0.05)。行为学研究结果显示,与autism模型大鼠相比,Sulindac预处理,大鼠的痛闽相对正常；重复刻板动作减少；学习和记忆能力有所提高。以上结果表明,Wnt信号通路抑制剂Sulindac预处理,能削弱Wnt信号通路的亢进机能,从而减少氧化应激的发生,最终使autism模型鼠的异常行为获得不同程度的改善。三、采用细胞培养技术探讨了Wnt/β-catenin通路与氧化应激在autism发生过程中的作用。应用Real-time PCR, Western blot及流式细胞分析(Flow analytical cytometry system, FACS)技术深入研究VPA处理的原代培养神经元Wnt/β-catenin与氧化应激的关系。Real-time PCR及Western blot结果显示,在VPA处理培养神经元中,GSK-3βmRNA及蛋白表达显著低于对照组,失活的P-GSK-3p显著高于对照组；而P-catenin mRNA及蛋白表达显著高于对照组,抑制性的P-β-catenin显著低于对照组。同时,在VPA处理培养神经元中,4-HNE表达显著高于对照组。FACS研究结果显示,VPA处理组ROS表达水平显著高于对照组。Sulindac处理以后,与VPA处理组相比,β-catenin蛋白表达下调,P-β-catenin表达上调,GSK-3p表达上调,P-GSK-3p表达下调,4-HNE下调。Real-time PCR结果显示,抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)处理虽然减少了ROS的产生,但是并没有改变GSK-3β mRNA和P-catenin mRNA的表达。以上结果揭示,Wnt/β-catenin通路活性增强导致氧化应激的产生,VPA促进神经元氧化应激的产生由于该通路上调所致。综上所述,我们的工作提示：环境因素(如VPA暴露)通过诱导脑组织Wnt/β-catenin通路活性改变,使脑内经典Wnt信号通路活性增强,进而增加氧化应激的产生、氧化稳态的异常,有可能进一步影响神经元的正常发育和联系,阻碍了正常的神经网络形成,从而引起社会交往、情绪和语言等行为方面的异常,最终导致autism的发病。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R749.94

【参考文献】