视网膜新生血管化相关因子基因多态性与ROP的关联研究

发布时间：2018-04-17 06:35

本文选题：早产儿视网膜病变 + 视网膜新生血管化　；参考：《南方医科大学》2013年博士论文

【摘要】：背景早产儿视网膜病变(Retinopathy of prematurity,ROP)是一种发生于小胎龄、低体重的早产婴儿中的血管增殖性视网膜病变,在世界范围内,ROP是导致儿童视力损失和失明的主要病因。随着新生儿监护技术的提高,极低与超低出生体重儿的存活率不断上升,导致ROP的高危人群也不断扩大。所以尽管ROP的诊疗技术取得了很大进展,但该症仍然是早产儿视力损害和致盲的最主要原因。在出生体重低于1250克的早产儿中ROP有50%的发病率,其中,10%发展为3期病变。视网膜脱离一般发生于3期病变以上的重症患者,大部分为退行性病变。ROP的主要病理特征是视网膜新生血管化,血管的异常增生引起视网膜脱离、黄斑皱褶、近视、弱视、斜视,最终可能导致视力损失和失明。ROP的病因未完全明了,多种因素增加ROP的危险性,尤其是早产、低出生体重和氧气治疗与ROP的发病相关。近年来临床研究发现,ROP在白人中的患病率明显高于黑人,男性的发病率高于女性。更发现在给予严格及时的干预治疗后,有的患儿ROP可以自行消退,有的却不断发展。提示遗传背景不同可能造成这些差别,基因差异不仅与ROP发病的风险有关,而且会影响ROP的程度。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是最常见的基因变异,包括血管内皮生长因子在内多种血管调节因子与视网膜新生血管化有密切关系,评价视网膜新生血管化相关因子的基因多态性对ROP发病的影响将有助于高风险人群的早期鉴别与及时干预。近年来,来自发达国家的学者已经对多个血管调节因子基因多态性与ROP的关联性展开了多项研究,为遗传因素对ROP发病的影响提供了警示。然而,这些研究往往局限于单个候选基因的个别位点,缺乏对多基因、多位点的联合研究,使结·果缺乏准确性；并且由于研究方法不同和目标人群的种族差异,导致很多结果互相矛盾,缺乏肯定性的结论。而国内该领域的研究更是几乎空白。目的：早产儿视网膜病变(ROP)是常见的儿童致盲性疾病,视网膜新生血管化异常是ROP的主要病理特征。本研究拟在中国汉族人群中,采取候选基因策略、病例对照研究的方法,应用质谱分析等SNP分型技术,联合分析多基因的多个SNP位点对不同程度ROP发病的影响。以验证视网膜新生血管化相关因子基因多态性与ROP的关联性,识别和评价遗传因素对ROP发生发展的作用。结果对ROP的防治与管理有重要指导意义,并为探讨ROP的发病机制、易感基因的筛查及未来的基因治疗奠定理论与实验基础。方法： 1采取病例-对照研究,研究对象为2011年1月至2012年12月期间,在深圳市妇幼保健院新生儿科住院的早产儿。由同一眼科医师通过双目间接检眼镜或广角数码视网膜成像系统(RetcamⅡ)进行ROP筛查,ROP的筛查、诊断、分期标准依据2004年中华医学会制定的《早产儿治疗用氧和视网膜病变防治指南》。在完成筛查的早产儿中,选择胎龄32周或出生体重1500g的早产儿。其中,随机选择90例筛查正常的早产儿为对照组,根据ROP病变严重程度将ROP患儿分别选入重症组和轻症组,重症组73例,轻症组78例,3组共241例。重症组包括阈值前1型ROP、阈值ROP、4、5期ROP及急进性后部型ROP(AP-ROP),患儿需要接受激光光凝或玻璃体视网膜手术治疗；轻症组包括1、2期ROP、未达到阈值病变标准的3期ROP及以上各期瘢痕期ROP,患儿不需要进行手术治疗。均排除家族性渗出性视网膜病变家族史、其他眼底病变者、Norrie's disease、糖尿病、严重心脏病、呼吸性疾病、肝肾功能异常及其他全身血管异常性疾病。所有患儿均为汉族,无血缘关系。本项研究获得受试者家长签名的书面知情同意书和我院伦理委员会的批准。 2参考国外文献,选择7种视网膜新生血管化相关因子的基因作为候选基因,检测其中14个SNP位点的多态性。 3所有受检者各取外周静脉血0.5ml,置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管,保存在-80℃冰箱。采用血液基因组抽提试剂盒提取DNA。根据引物设计原则,采用Primer Premier5.0软件自行设计引物序列,PCR仪扩增后得到目标PCR片段备用。 4分别采用MassARRAY时间飞行质谱系统、PCR凝胶电泳法、直接测序法对相关基因位点进行单核苷酸多态性检测。 5本研究采用独立样本t检验比较胎龄、出生体重的组间差异；采用卡方检验比较性别的组间差异；采用卡方检验分析组间各SNP位点基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡,以判定样本的群体代表性；采用卡方检验比较各位点基因型频率及基因频率的组间差异；对于多个样本率的多重比较采用Bonferroni法对检验水准进行校正,即将原来设定的检验水准除以检验次数,得到实际用于确定统计学意义的检验水准；校正胎龄、出生体重等相关风险因素,采用双变量Logistic回归分析法对卡方检验中有显著性意义的SNP位点基因型与ROP做多因素关联分析,比较各位点基因型对不同程度ROP发病的影响,计算比值比(Odds ratio, OR)和95%可信区间(confidence interval, CI)。检验水准α=0.05,即P0.05说明具有统计学差异,所有资料均经过Microsoft Excel软件录入,应用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果： 1一般资料比较 SNP位点基因分型成功230例,成功率为95.4%。其中,对照组90例成功分型85例,重症组73例成功分型71例,轻症组78例成功分型74例。共有11人剔除出研究,对分型成功的230例早产儿相关资料进行分析。采用卡方检验对轻症组、重症组、对照组三组间的性别进行比较。各组间性别分布无显著差异,χ2=0.7478,P=0.787,0.05；采用独立样本t检验分别对轻症组与对照组、重症组与对照组、重症组与轻症组之间的胎龄与体重吸氧时间、机械通气时间等进行比较,重症组婴儿胎龄、出生体重、吸氧时间、机械通气时间均明显低于对照组与轻症组；轻症组婴儿胎龄与出生体重亦明显低于对照组,差别均有显著意义,P0.05。 2遗传平衡检验经Hardy-weinberg定律吻合度检测,达到遗传平衡,Hardy-Weinberg平衡检验：三组中各等位基因频率分布均服从Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P0.05,),说明群体基因遗传平衡,数据来自同一孟德尔群体,证实抽样和分型结果可靠。样本具有群体遗传代表性。 3各基因SNP位点基因型及等位基因频率的组间比较 3.1VEGF基因SNP位点基因型及等位基因频率的组间比较 VEGF基因+405、+936基因型频率在三组间有显著性差异(分别为P=0.000,P=0.010,0.05)；而VEGF基因-460、-2578基因型频率在三组间无显著性差异(分别为P=0.87,P=0.98,0.05)。其中,VEGF基因+405基因型频率分布在重症组与对照组、重症组与轻症组之间有显著差异(两组均为P=0.000,0.017),而在轻症组与对照组间基因型频率分布无显著性差异(P=0.873,0.017); VEGF基因+936基因型频率分布在重症组与对照组之间有显著差异(P=0.010,0.017),而在轻症组与对照组、重症组与轻症组间无显著性差异(分别为P=0.552,P=0.055,0.017)。 VEGF基因+405、+936等位基因频率在三组间有显著性差异(分别为P=0.000,P=0.002,0.05)；而-460、-2578等位基因频率在三组间无显著性差异(分别为P=0.990,P=0.429,0.05)。其中,VEGF基因+405等位基因频率在重症组与对照组比较、重症组与轻症组比较,有显著性差异(分别为P=0.000,P=0.015,0.017),重症组与对照组间,相对于G等位基因,携带C等位基因发生重症ROP的风险度为2.711(OR:2.711,95%CI:1.709-4.302);重症组与轻症组间,相对于G等位基因,携带C等位基因者发生重症ROP风险度为1.798(OR：1.798,95%CI：1.121-2.885)。VEGF基因+936等位基因频率在重症组与对照组比较有显著性差异(P=0.001,0.017),相对于C等位基因,携带T等位基因发生重症ROP的风险度为2.684(OR：2.684,95%CI：1.521-4.739) 3.2PEDF基因各SNP位点基因型及等位基因频率的组间比较 PEDF基因-5376基因型频率分布在三组间有显著性差异(P=0.003,0.05)。其中,重症组与对照组之间有显著差异(P=0.000,0.017)；而轻症组与对照组、重症组与轻症组间基因型频率分布无显著性差异(分别为P=0.472,P=0.24,0.017)。而+311基因型频率在各组之间的分布无显著差异(P=0.182,0.05)。 PEDF基因-5376等位基因频率在三组间有显著性差异(P=0.003,0.05),而+311等位基因频率组间无显著差异(P=0.383,0.05)。其中,PEDF基因-5376等位基因频率在重症组与对照组比较、重症组与轻症组比较有显著性差异(分别为P=0.001,P=0.009,0.017),而轻症组与对照组无显著性差异(P=0.531,0.017)。重症组与对照组间,相对于C等位基因,携带T等位基因发生重症ROP的风险度为2.213(OR:2.213,95%CI:1.371-3.572);重症组与轻症组间,相对于C等位基因,携带T等位基因发生重症ROP的风险度为1.919(OR:1.919,95%CI:1.170-2.883.1485)。 3.3eNOS基因SNP位点基因型及等位频率的组间比较 eNOS基因-786、+894基因型频率在三组之间无显著性差异(分别为P=0.590, P=0.834,0.05); eNOS基因-786与+894等位基因频率在三组之间无显著差异(分别为P=0.231,P=0.410,0.05)。 3.4IGF-1R基因SNP位点基因型及等位基因频率的组间比较 IGF-1R基因+3174基因型、等位基因频率在三组之间未发现显著性差异(分别为P=0.25,P=0.661,0.05)。 3.5Ang-2基因SNP位点基因型及等位基因频率的组间比较 Ang-2基因+35基因型、等位基因分布频率在三组之间未发现显著性差异(分别为P=0.951,P=0.892,0.05)。 3.6ACE基因型及等位基因频率的组间比较 ACE基因I/D基因型、等位基因在三组之间分布频率未发现显著性差异(分别为P=0.777,P=0.773,0.05)。 3.7ND基因SNP位点基因型及等位基因频率的组间比较采用质谱检测法对ND基因Val60Glu、Ala105Thr位点多态性进行检测,DNA直接测序法对+597C/A多态性进行检测,未发现上述位点的基因多态性。其中Val60Glu等位基因全部为T, Ala105Thr等位基因全部为G,+597等位基因全部为C。 3.8相关SNP与ROP关联性的logistic分析采用二分类Logistic回归分析相关SNP与ROP关联性。校正胎龄和出生体重后,在重症组与对照组间,VEGF基因+405G/C、+936C/T多态性及PEDF基因-5376C/T基因多态性与重症ROP显著相关(分别为P=0.010；P=0.023；P=0.045,0.05)。其中,VEGF基因+405GG基因型与CC基因型相比,患重症ROP的风险度为0.140(OR:0.140,95%CI:0.039-0.505),有统计学意义(P=0.003；0.05)；VEGF基因+936CT基因型与CC基因型相比,患重症ROP的风险度为3.281(OR：3.281,95%CI：1.272-8.462),有统计学意义(P=0.014；0.05)；PEDF基因-5376CT基因型与TT基因型相比,患重症ROP的风险度为0.315(OR：0.315,95%CI：0.121-0.817),有统计学意义(P=0.018；0.05)。在轻症组与重症组间,VEGF基因+405G/C基因多态性与重症ROP显著相关(P=0.000,0.05)。其中,GG、GC基因型与CC基因型相比,患重症ROP的风险度分别为0.088(OR：0.088,95%CI：0.028-0.279)和0.276(OR:0.27,95%CI:0.110-0.693),有统计学意义(分别为P=0.000；P=0.006；0.05)。此外,在重症组与对照组、重症组与轻症组间,VEGF基因-460TT/+405CC单倍型组合均显著增加了患重症ROP的风险(OR:5.319,95%CI:2.034-13.904, P=0.001)和(OR:3.878,95%CI:1.693-8.885, P=0.001);相反,在重症组与对照组、重症组与轻症组间,-460TT/+405GG单倍型组合均显著降低了患重症ROP的风险(OR:0.121,95%CI:0.022-0.660, P=0.015)和(OR:0.289,95%CI:0.123-0.680, P=0.019)。结论：本次实验中共研究了7种视网膜新生血管化相关因子的基因,对其中的14个SNP位点进行分型检测,发现VEGF基因+405G/C、+936C/T多态性及PEDF基因-5376C/T多态性与重症ROP显著相关,与轻症ROP没有相关性。VEGF基因+405CC、+936CT基因型及PEDF基因-5376TT基因型可能是重症ROP的易感基因型；VEGF基因+405C、+936T等位基因及PEDF基因-5376T等位基因可能是重症ROP的风险等位基因；VEGF基因-460TT/+405CC单倍型组合可能是重症ROP的风险单倍型组合。推测相关基因多态性在基因转录水平上影响了血管因子的正常表达。研究中同时发现VEGF基因+405基因型和等位基因频率及PEDF基因-5376等位基因频率在重症组与轻症组之间也存在显著差异,提示轻症与重症ROP之间存在不同的遗传背景,基因变异可能在重症ROP的发病中起重要作用,而轻症ROP可能主要受环境等其它因素影响。这对于进一步识别和评价遗传因素对ROP发生发展的危险性,阐明ROP发生、发展的分子遗传机制具有重要的理论和现实意义。通过本研究发现的与我国汉族人群ROP易感性相关的危险基因型,验证后有望为分子标志物用于筛选高危人群,对ROP实施有效和目标明确的个体预防、早期诊断和预后判断等均具有重要的意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R722.6

【参考文献】