Orexin-A对性早熟的影响及其机制研究
本文选题：促食素 + 中枢性性早熟 ； 参考：《扬州大学》2017年硕士论文
【摘要】：研究目的研究促食素(Orexin-A)对中枢性性早熟(CPP)大鼠性发育进程的影响,观察Orexin-A干预后CPP大鼠下丘脑中母源性表达的基因3(MEG3)及吻肽(Kisspeptin)的表达,分析Orexin-A、MEG3及Kisspeptin表达之间的潜在关系,探讨Orexin-A影响CPP的机制。对象与方法1.大鼠性早熟模型的建立及动物分组5日龄雌性SD大鼠48只,随机分为4组:正常对照组(Group 1),早熟模型组(Group 2),早熟模型+生理盐水组(Group 3),早熟模型+Orexin-A组(Group 4),每组12只。适应性喂养两天后,模型组大鼠每只皮下注射所配制的300 μg达那唑溶液以建立性早熟模型,正常对照组每只皮下注射等体积的生理盐水。对第4组大鼠,在15日龄时侧脑注射0.5 nmol/L Orexin-A,一天一次,直到实验结束。第3组大鼠侧脑注射等体积生理盐水。当大鼠达到20日龄时,观察大鼠阴门开口情况,并记录大鼠阴门开口日。自阴门开口日起,记录20天阴门开口情况。将每组大鼠进一步细分为青春期启动前阶段、青春期启动阶段及青春期启动后阶段。分别在上述相应的阶段处死大鼠,取出大鼠卵巢和子宫样本,根据器官指数=器官湿重/体重,计算卵巢指数与子宫指数。迅速分离的下丘脑组织液氮冻存。2.Western blot 法将液氮中保存的下丘脑组织取出碾碎后,RIPA裂解组织,使用Bio-Rad蛋白分析试剂盒测定总蛋白浓度。将所有提取出的蛋白质用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离转膜,测定MEG3及Kisspeptin蛋白水平。3.定量实时PCR法(qRT-PCR)使用RNeasy试剂盒提取总RNA,逆转录为cDNA,荧光定量法检测下丘脑MEG3和Kisspeptin mRNA的表达水平。4.染色体免疫沉淀分析(ChIP试验)采用Chip试剂盒分析Kisspeptin启动子区域组蛋白的乙酰化状态,从而检测大鼠下丘脑中乙酰化组蛋白H3和H4与Kisspeptin启动子结合能力。5.细胞培养及转染DMEM培养HT22细胞,保持细胞密度低于80%以防止细胞过度生长。构建pcDNA-MEG3 载体以过表达 MEG3,使用 Lipofectamine 2000 将 pcDNA-MEG3 或 pcDNA,转染至HT22细胞,qRT-PCR及Western blot检测实验检测Kisspeptin的mRNA水平和蛋白水平。ChIP实验检测蛋白H3、H4与Kisspeptin启动子结合水平。结果1.Orexin-A延缓大鼠中枢性性早熟症状通过观察大鼠阴道开口时间以及2个规则的性周期发生时间,结果发现,与正常对照组大鼠相比,第2组和第3组大鼠阴道开口时间明显较早。第4组大鼠与第3组相比,阴道开口时间较晚。四组大鼠中性周期发生时间趋势与此相同,Orexin-A推迟了性早熟大鼠性周期发生时间。在青春期阶段,第2组和第3组大鼠的子宫指数和卵巢指数均大于第1组大鼠的子宫指数和卵巢指数,第4组大鼠的子宫指数和卵巢指数较第3组小。以上结果表明,Orexin-A可延缓大鼠中枢性性早熟症状。2.Orexin-A抑制中枢性性早熟大鼠下丘脑中MEG3的表达利用荧光定量PCR检测4组大鼠的下丘脑中MEG3水平,结果发现,早熟模型大鼠与正常鼠相比,下丘脑中MEG3表达增加,而注射Orexin-A逆转下丘脑中MEG3表达的变化3.Orexin-A抑制中枢性性早熟大鼠下丘脑中Kisspeptin的表达荧光定量PCR和Western blot检测4组大鼠的下丘脑中Kisspeptin水平,结果发现,早熟模型大鼠与正常鼠相比,下丘脑中Kisspeptin的表达增加,而注射Orexin-A逆转下丘脑中Kisspeptin表达的变化。4.Orexin-A降低中枢性性早熟大鼠中乙酰化组蛋白H4与Kisspeptin启动子结合利用ChIP试验检测大鼠中乙酰化组蛋白H3和H4与Kisspeptin启动子结合能力。结果示,四组大鼠下丘脑中乙酰化组蛋白H3与Kisspeptin启动子结合能力无差异。早熟模型大鼠与正常鼠相比,下丘脑中乙酰化组蛋白H4与Kisspeptin启动子结合增加,而注射Orexin-A逆转下丘脑中这种结合的变化。5.体外细胞培养,HT22细胞过表达MEG3时组蛋白H4与Kisspeptin启动子结合增强,Kisspeptin表达增加为检测MEG3对Kisspeptin的调控作用,HT22细胞中转染pcDNA-MEG3以过表达MEG3。ChIP实验发现,HT22细胞过表达MEG3,组蛋白H4与Kisspeptin启动子结合增加。荧光定量PCR和Western blot检测发现,过表达MEG3时细胞中Kisspeptin表达增加。结论Orexin-A在大鼠中枢性性早熟中发挥重要作用,能抑制CPP大鼠的下丘脑-垂体-性腺轴的功能,延缓CPP进程,降低Kisspeptin的表达。MEG3可能参与了 Orexin A抑制Kisspeptin的作用通路。
[Abstract]:Objective To study the effects of orexin - A on the developmental progression of central nervous prematurity ( CPP ) rats , and observe the potential relationship between orexin - A , MEG3 and Kisspeptin . The rats were divided into 4 groups : normal control group ( Group 1 ) , early puberty model group ( Group 2 ) , premature model + physiological saline group ( Group 3 ) , early puberty model + orexin - A group ( Group 4 ) . Results 1 . Orexin - A delayed the expression of MEG3 in the hypothalamus of rats . The results showed that the expression of histone H4 and Kisspeptin in the hypothalamus of rats were significantly higher than those in the normal control group .
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R725.8
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，本文编号：1785716
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