肺炎支原体MLVA分型及其临床意义

发布时间：2018-04-23 15:07

本文选题：肺炎支原体 + real-time　；参考：《浙江大学》2016年硕士论文

【摘要】：研究背景及目的：近年来随着肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, MP)基因组学研究的发展,关于MP基因型与MP菌株变异、病情进展、耐药及治疗等方面的关系受到了越来越多的关注。在分子水平上对MP菌株进行分型可以较好地进行流行病学监测并研究疾病的发生发展和转归。目前国内外对MP菌株的传统分型方法受限于MP基因序列保守性,只有包含少量的点突变的开放阅读框架(Open reading frame, ORF)及MP管家基因、结构基因较难发现多态性,故对MP区分度较低。多位点可变重复序列分析(Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis, MLVA)是近年来发展起来的一种以PCR为基础,根据所检测的菌株基因序列中不同位点的、可变数目串联重复序列(Variable-number tandem repeats, VNTR)的重复单元拷贝数的差异来进行分子分型的技术。该分型方法可以将菌株分型变得更为细化,有利于临床诊断、治疗及流行病学的监测。为建立MLVA分型体系并探讨其临床意义,本文采用MP感染儿童的口咽拭子(Oropharyngeal swabs, OP)进行体外分离培养,将所获取的临床菌株采用双探针荧光定量聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)、基于P1黏附蛋白基因限制性酶切图谱(Restriction fragment length polymorphism, RFLP)及MLVA进行基因分型,旨在探讨MP菌株不同MLVA亚型的流行状况以及MLVA亚型与临床的关系,阐明MP分子流行病学现状,为临床诊断及治疗提供帮助。方法：(1) MLVA分型体系的建立：采用标准株及临床样本结合方法研究MP体外培养分离纯化的最佳条件。使用标准菌株MP-M129和MP-FH研究real-time PCR及MLVA分型最佳反应条件。(2) MLVA分型临床应用：以2014年3月-2015年4月浙江大学医学院附属儿童医院发热门诊及住院患儿1131例和两所正在流行MP感染小学的122名儿童的OP标本进行双探针real-time PCR确定MP阳性,筛选后在自制MP琼脂培养基中进行培养、分离、纯化及保存,所取得菌株再进行MLVA进行基因分型及Pl-RFLP对比。采集临床资料统计分析MP的发热率、平均发热天数、最高体温、激素使用率及病情轻重程度等指标是否与MLVA基因型有关。结果：(1)双探针Real-time PCR及临床所应用的MP商用检测试剂盒共检出217例临床MP阳性样本,以MP商用检测试剂盒为参照,双探针Real-time PCR法敏感性为92.3%、特异性91.7%；(2)MP体外培养、分离及纯化得到MP菌株共164株,以双探针Real-timePCR阳性为参照,分离率为66.67%(164/246)。其中来自门诊或住院为146株,来自MP暴发流行两所小学的有18株；(3)146份门诊或住院MP样本进行了MLVA分型,结果为MLVA A型(13例)、MLVA B型(1例)、MLVA E型(36例)、MLVA H型(1例)、MLVA J型(27例)、MLVA S型(1例)、MLVA P型(39例)、MLVA U型(20例)、MLVAX型(6例)。18份小学流行MP样本分型结果为MLVA J型(5例)与U型(13例),且同一所小学所流行的MP菌株为同一型。(4) MLVA亚型的临床资料比较分析发现,U型引起MP重症感染比率较其它各型高。结论：(1) 本研究所开发的双探针real-time PCR体系具有较高的敏感性和特异性,可用于临床检测；(2) 成功建立了MP体外分离培养体系,分离率66.67%,与国外实验室水平相仿；(3) U型MP易引起MP重症感染。
[Abstract]:In recent years , with the development of mycoplasmal pneumonia ( MP ) gene group , the relationship between MP genotype and MP strain variation , disease progression , drug resistance and treatment have been paid more and more attention . ( 2 ) Clinical application of MLVA typing : A double - probe real - time PCR was used to determine MP positive by double - probe real - time PCR . The results were as follows : ( 1 ) The sensitivity of double - probe Real - time PCR and clinical application of MP was 92.3 % and 91.7 % , respectively .
( 2 ) In vitro culture , isolation and purification of MP strains , 164 strains of MP were isolated and purified by double - probe Real - time PCR , with a separation rate of 66.67 % ( 164 / 246 ) . Among them , 146 were from outpatient or inpatient , 18 from MP outbreak and two primary schools ;
( 3 ) MLVA typing was performed in 146 outpatient or hospitalized MP samples , the results were MLVA type A ( 13 cases ) , MLVA type B ( 1 case ) , MLVA type E ( n = 36 ) , MLVA type H ( n = 39 ) , MLVA J type ( 20 cases ) , MLVA type ( 6 cases ) , MLVA P type ( 39 cases ) , MLVA U type ( 20 cases ) , MLVA type ( 6 cases ) .
( 2 ) The isolation and culture system of MP in vitro was successfully established , the separation rate was 66.67 % , which was similar to the foreign laboratory level ;
and ( 3 ) the U - type MP is easy to cause MP severe infection .

【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R725.6

【参考文献】