靶向抑制自噬关键蛋白Beclin1对HCMV潜伏感染的影响

发布时间：2018-05-06 20:30

本文选题：HCMV + 自噬　；参考：《浙江大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:人巨细胞病毒(HCMV)属于疱疹病毒β亚科,人群普遍易感,在成年人中的感染率高达90%,而我国孕妇的感染率更高,达95%以上。虽然HCMV原发性感染在个体免疫功能健全时并不引起临床症状,但初次感染后可在体内建立潜伏感染,待宿主免疫功能受限时,可导致严重的临床后果,如肝炎,脑炎乃至死亡。更为重要的是,在先天性感染中,大约10%～15%被感染的新生儿有临床症状,表现为黄疸型肝炎、肝脾肿大、肺炎等严重的临床后果。而在无症状的患儿中,10%～17%会发展为耳聋或者神经发育异常。自噬(autophagy)是一种由溶酶体介导将体内衰老的细胞器或者错误折叠的蛋白降解成小分子氨基酸的降解通路。它不仅可以抵御病原体的侵袭,还通过为细胞提供能源来维持细胞内环境的稳态。近年来,关于HCMV与自噬的关系的研究也日趋增多,并取得了阶段性的进展。但这些研究都是在HCMV增殖感染模型上进行的,目前有关自噬水平变化与HCMV潜伏感染的关系尚无文献报道。明确自噬水平变化对HCMV潜伏感染的影响,有助于了解HCMV潜伏感染的机制,并为临床HCMV的预防与治疗提供新的思路。方法:本研究包括两部分内容:(1)建立HCMV潜伏感染模型:用HCMVTowne株感染人急性单核白血病细胞(human acute monocytic leukaemia cell line,THP-1)作为实验组,以未感染的THP-1细胞作为空白对照组,在感染后1d、3d、5d、7d、9d时,去除培养液,并收集细胞。提取细胞内的DNA,荧光定量检测THP-1细胞内HCMVDNA拷贝数;Trizol法提取细胞总RNA后,RT-PCR检测HCMV UL122、UL123和UL138基因的表达水平;RIPA裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白后,western blot检测HCMVIE蛋白和UL138蛋白表达水平。确定是否建立了HCMV潜伏感染模型。(2)靶向抑制自噬关键蛋白Beclin1对HCMV潜伏感染的影响:构建Beclin1的干扰慢病毒载体,并筛选出有效的干扰慢病毒载体及作用浓度。以HCMVTowne株感染THP-1细胞作为阴性对照组,以HCMVTowne株+空白载体转染THP-1细胞作为空白对照组,以HCMV Towne株+Beclin1干扰慢病毒载体转染THP-1细胞作为实验组,并从透射电镜观察自噬体数量的变化、RT-PCR检测Beclin1、Atg5、Atg7、LC3、UL122、UL123、UL138mRNA水平,以及western blot检测Beclin1、Atg5、Atg7、LC3、IE、UL138蛋白水平这三个方面了解Beclin1干扰慢病毒载体是否引起细胞自噬水平的变化以及自噬水平变化后对H C MV潜伏感染状态的影响。结果:成功建立了 HCMV潜伏感染的模型。荧光定量PCR来检测HCMV DNA的拷贝数,其结果表明:HCMV Towne株感染THP-1细胞1d、3d、5d,HCMVDNA拷贝数逐渐增加,感染5d、7d、9d,DNA拷贝数逐渐减少;RT-PCR的结果显示:HCMV Towne株感染THP-1细胞后,在感染早期有HCMV即刻早期IE基因(UL122、UL123)的表达,UL122基因mRNA水平在感染后的1d、3d均有表达,5d后基本不表达;UL123基因mRNA表达水平则不明显;在感染早期,潜伏相关基因UL138mRNA的表达水平则不明显;随着感染时间的延长,HCMV UL138基因逐渐表达增加。Western blot的结果表明:HCMVTowne株感染THP-1细胞后,IE蛋白在感染后1d、3d有表达,而感染5d后未检测到IE蛋白的表达,但UL138蛋白则持续表达。透射电镜结果显示:在非连续区域,随机选取5个细胞,正常THP-1细胞组平均每个细胞自噬体的数量为3个,不转染慢病毒载体组10个,转染GV248空白载体组9个,转染GV248-Beclin1-9244组6个;Beclin1干扰慢病毒载体转染后,与正常THP-1细胞相比,自噬体数量是增加的;但与不转染慢病毒载体组以及转染GV248空白载体组相比,自噬小体数量是减少的,因此,转染Beclin1干扰慢病毒载体后自噬体数量有所减少。与阴性对照组组及空白对照组相比,实验组的自噬相关基因Beclin1、Atg5、Atg7和LC3的转录和蛋白表达水平明显减少,而与病毒复制和潜伏相关基因UL122和UL138的转录和蛋白表达水平并无明显变化。荧光定量PCR检测HCMVDNA拷贝数结果显示:与阴性对照组及空白对照组相比,在未建立潜伏感染时,实验组的HCMVDNA拷贝数在第5d时下降较明显,而在潜伏感染建立后,三组的DNA拷贝数并无明显的差异,且仍能被检测到。结论:(1)成功建立了 HCMV Towne株在THP-1细胞上的潜伏感染的模型;(2)下调Beclin1的表达,并不影响HCMV进入潜伏感染的时间点或HCMV潜伏感染状态。
[Abstract]:Objective : Human cytomegalovirus ( HCMV ) belongs to herpes simplex virus 尾 subfamily . The infection rate of human cytomegalovirus ( HCMV ) in adult is up to 90 % , and the infection rate of human cytomegalovirus ( HCMV ) is more than 95 % . After extraction of the total protein , the expression level of HCMVIEprotein and UL138 protein was detected by western blot , and the model of HCMV latent infection was established . The results showed that HCMV - Towne strain was infected with THP - 1 cells . The results showed that HCMV - Towne strain was infected with THP - 1 cells . The results showed that HCMV - Towne strain was infected with THP - 1 cells . The results showed that HCMV - Towne strain was infected with THP - 1 cells . The results showed that HCMV - Towne strain was infected with THP - 1 cells . The results showed that : ( 1 ) The number of autophagy cells in the experimental group was decreased compared with that of normal THP - 1 cells . The results showed that : ( 1 ) The number of autophagy cells was decreased in the experimental group compared with the control group and the blank control group .

【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R725.1

【参考文献】