广州儿童呼吸道病原体流行与气候相关性及呼吸道合胞病毒诊断技术研究

发布时间：2018-05-10 18:47

本文选题：急性呼吸道感染 + 呼吸道病原体　；参考：《广州医科大学》2017年博士论文

【摘要】：目的急性呼吸道感染(ARI)一直是困扰人类最常见、发生率最高的疾病,其病原复杂多样,且很难从症状上判断感染种类。广州由于其特殊的地理位置,湿热的气候,紧邻东南亚,国内外人员活动频繁的特点一直是各种呼吸道病原体的活动温床,而呼吸道病原体的精确诊断和流行病学研究对疾病防治具有重要意义。方法(1)本研究采集2009.7至2016.6广州ARI患者(≤14岁)咽拭子,采用荧光定量PCR方法检测18种常见呼吸道病原体,并收集期间广州气象数据包括月平均气温、平均相对湿度、平均风速,平均气压、平均水汽压及日照时数,分析病原体在广州地区的流行规律及其与气候因素的相关性;(2)根据RSV M2-1转录抗终止因子作用,将M2-1克隆至pcDNA3.1(+),通过转染、筛选获得稳定表达M2-1的Hep-2细胞株,并对稳定表达细胞株的生长特性及RSV感染特性进行分析;(3)以Taqman荧光定量PCR技术为基础,以RSV-A、RSV-B的G基因特异保守区、管家基因ACTB设计引物探针建立多重荧光定量PCR,通过多种呼吸道病原体验证其特异性,以体外转录的RNA验证其灵敏度并建立标准曲线。对2013.1至2015.12期间广州ARI患者(≤14岁)咽拭子进行RSV-A、RSV-B检测并收集病历信息,首次采用相对病毒载量CVL方法进行呼吸道样品的病毒定量,分析广州地区感染RSV-A/RSV-B的流行状况及患者临床表现,探讨利用内参基因进行相对定量分析的可行性。结果(1)本研究在七年间收集11399例ARI患者咽拭子,对其进行18种常见呼吸道病原体检测。49.2%(5606/11399)的患者检测出一种或多种病原体阳性,在阳性患者中,检出率最高的为RSV(1690/5606,30.1%)、infA(839/5606,15.0%)、MP(760/5606,13.6%)、ADV(621/5606,11.1%)、HRV(402/3789,10.6%),接着是OC43、HMPV、infB、PIV3、HBoV,阳性率6.2%-4.4%,剩余的7种病原体PIV1,CP,PIV2,229E,NL63,HKU1,PIV4的阳性率均低于4.0%。病原体在不同年龄患者中分布有四种模式:1)阳性率随着年龄的增大而减少,包括RSV(p0.001);2)随着年龄增大而增多,包括infA和infB(p0.001);3)在0-14岁患者中发现感染高峰,包括EV、HRV、ADV、MP、PIV3、OC43、HBoV、HMPV(p≤0.025);4)无显著差异或者数量太少无法统计,包括PIV1、PIV2、PIV4、229E、NL63、HKU1、CP。总体来说,随着季节更替时,样本阳性率升高或降低:1)阳性率升高:在6-9月份之间(夏转秋)及4-5月份(春转夏)常有阳性率的高峰;2)阳性率降低:在10-12月份之间(秋转冬)及1-3月份(冬转春)常有阳性率低谷。通过多元线性回归分析,有显著线性关系的有:标本阳性率与平均气温、平均相对湿度、日照时数(p≤0.002),RSV与平均相对湿度、日照时数(p≤0.034),MP与平均气温(p=0.003),ADV与日照时数(p=0.008),EV与平均气温、平均相对湿度(p≤0.039),HMPV与日照时数(p=0.004),PIV3与平均气温、平均相对湿度、日照时数(p≤0.049),HBoV与平均气温、平均相对湿度(p≤0.024)。(2)本研究通过pcDNA3.1(+)质粒构建携带M2-1载体,转染并通过筛选获得稳定表达RSV M2-1的Hep-2 2F5细胞,通过对比Hep-2 2F5与原始Hep-2细胞的生长曲线及培养观察,Hep-2 2F5增殖速度高于Hep-2;通过对比Hep-2 2F5与原始Hep-2细胞感染RSV的特点,发现Hep-2 2F5对RSV更加敏感,更加易感,但其病毒产量低于原始Hep-2细胞。(3)本研究根据RSV-A和RSV-B的G基因特异保守区及ACTB基因建立了多重荧光定量检测方法,使用一系列呼吸道病原体检测无非特异性扩增,RSV-A、RSV-B、ACTB可分别检测到最低4 copies/μl、8 copies/μl和12 copies/μl的体外转录RNA模板,并且分别在10 1′1010 copies/μl(r2=0.9973)、100 1′1010 copies/μl(r2=0.9989)和100 1′1010 copies/μl(r2=0.9984)的RNA模板浓度范围内具有很好的线性。在三年时间共收集、检测5483例ARI患者(≤14岁),总人数13.3%(729/5483)的患者为RSV阳性,其中RSV-A、RSV-B分布占51.2%(373/729)和48.8%(356/729)。在2013和2015年各年份主要流行亚型分别为RSV-B和RSV-A,而2014年则是两种亚型都有流行。在临床表现上,在RSV-A和RSV-B阳性患者之间发现在流涕、呼吸困难、细支气管炎、寒战、头疼、肌痛、乏力、呕吐、纳差、腹泻、皮疹等(p≤0.01)临床症状的发生频率上有显著差异。不同的RSV CVL患者主要在细支气管炎、发热(≥38°C)(p≤0.009)的发生频率上有显著差异。结论(1)本次研究通过在广州对14岁以下ARI患者18种常见呼吸道病原体及其亚型的七年监测分析:1)了解了当地常见呼吸道病原体的分布构成情况;2)获得了常见呼吸道病原体在14岁以下患者这个的年龄分布模式;3)获得了当地呼吸道病原体的季节分布特点及其与气候因素的相关性。(2)本研究根据其M2-1的功能:1)以Hep-2为基础构建成功稳定表达M2-1的Hep-2 2F5;2)获得了Hep-2 2F5的生长特点、RSV感染特点;3)为RSV培养分离提供备选细胞。(3)本研究根据RSV亚型基因特点及管家基因ACTB:1)建立了新型的RSV亚型多重荧光定量PCR诊断方法;2)获得广州RSV-A、RSV-B的流行病学资料;3)首次提出使用CVL评价方法进行呼吸道样品中的病原体定量。本研究在病原体快速诊断、培养分离和流行病学的工作希望为疾病的防治、临床诊断、药物、疫苗开发等作出一些贡献。
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【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R725.6

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