小鼠骨髓源间充质干细胞对小鼠ITP模型治疗作用及机制的研究

发布时间：2018-06-07 03:25

  本文选题：间充质干细胞 + 诱导分化　； 参考：《青岛大学》2017年博士论文

【摘要】：目的:免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia,ITP)是一种常见的自身免疫性出血性疾病,目前尚无有效的治疗策略,其中慢性难治性ITP有较高死亡率,因治疗疾病本身的影响及治疗相关并发症,患者生活质量差,尽管国内外学者对ITP治疗进行了大量基础与临床研究,这些问题仍然没有得到有效解决,因此寻找新的治疗策略以克服当前治疗方法的不足,成为当今研究的热点,其中间充质干细胞有可能成为一个选择,但是相关的研究资料很少,尚不能为临床治疗提供充足的理论依据。本研究旨在建立一种稳定、高效的从小鼠骨髓中分离间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)的方法,并通过对其基本的生物学特性,免疫表型、多向分化潜能及对ITP小鼠模型的治疗作用和其可能的作用机制的研究,以期进一步了解BM-MSCs的生物学特性和临床应用的实际价值,为ITP的治疗提供新的研究方向。方法:本实验研究分为3部分:1、取健康6周C57/BL6小鼠采用颈脱臼法处死,然后分离四肢骨,用PBS冲洗骨髓腔收集骨髓,离心去上清,将采集的骨髓液全部投入培养基中,利用间充质干细胞贴壁生长的特性,采用全骨髓贴壁法培养,多次换液分离出贴壁细胞,并通过传代培养进行细胞的纯化和扩增,在倒置相差显微镜下对细胞生长形态进行观察拍照;取P3代MSCs,用流式细胞仪进行MSCs免疫表型分析;取一定数量P3代细胞分别在脂肪和成骨诱导培养体系中向成脂、成骨诱导分化,诱导一定时间后采用茜素红及油红O染色进行染色鉴定,以观察其多向分化的潜能。2、颈椎脱臼法处死8周龄雄性WTC57BL6小鼠,采用眼球摘除法取血,离心收集富含血浆的血小板,并将1×108的血小板通过尾静脉注射入CD61KO小鼠体内,输入血小板后通过测CD61KO小鼠血清内anti-CD61 Ig G含量,了解免疫是否成功,免疫成功后处死小鼠取其脾脏,研碎制成脾细胞悬液,在6h内把5×104个上述收集的脾细胞腹腔注射经过200c Gy射线照射全身的重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠,通过检测SCID小鼠的血小板变化来判断血小板减少水平,以建立稳定的小鼠ITP模型。3、将雄性SCID小鼠分为3组:SCID小鼠对照1组(未处理组)、对照2组(ITP组)、实验组(ITP+BM-MSCs组),实验组给予输注1×106个MSCs,对照组给予同等体积的生理盐水输注,输注后在4d、8d、12d、16d测不同组小鼠血小板水平、并分别在第7d、14d、21d天每组随机处死3只小鼠,检测不同组小鼠外周血和脾脏Treg水平,同时测7d时三组小鼠血清细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的变化。结果:1、全骨髓贴壁法分离间充质干细胞成功率100%,倒置显微镜下细胞呈形态均一的梭形,成平行或旋涡状生长;流式细胞仪检测结果显示贴壁细胞均高表达CD105、CD90及CD73,不表达造血细胞表型CD34、CD45和HLA-DR;成脂、成骨诱导多向分化潜能中,成脂诱导14d,可见大量脂滴形成,油红O染色呈强阳性,成骨诱导21d,茜素红染色可见矿化结节形成。2、CD61KO小鼠输入来自WTC57BL6纯化的血小板后,anti-CD61 Ig G的浓度在第14天上升至最高(39.14%±3.68%),至第28天Ig G+浓度均维持在较高水平(Ig G+30%)(44.45%±3.91%);经射线照射全身后的SCID小鼠在接受CD61KO小鼠重新免疫后的脾细胞后,血小板呈持续下降,在第7d、第14d、21d及28d血小板水平分别为(401.25±65.34)×109/L、(336.38±60.19)×109/L、(267.38±59.58)×109/L和(209.63±19.62)×109/L,和对照组2比较血小板水平升高明显,具有显著性差异(P0.01)。3、实验组小鼠在输入1×106个MSCs后,第4d、第8d、12d及16d血小板水平分别为(606.11±76.16)×109/L、(611.11±67.85)×109/L、(608.56±47.59)×109/L和(600.44±64.68)×109/L,和对照组2比较血小板水平升高明显,具有显著性差异(P0.01);实验组小鼠脾脏Treg细胞水平在第7d、第14d及21d分别为2.49%±0.03%、2.67%±0.04%及3.00%±0.02%,对照2组脾脏Treg细胞水平在第7d、第14d及21d分别为0.79%±0.03%、0.62%±0.07%及0.40%±0.04%,实验组小鼠脾脏Treg细胞水平明显高于对照2组,两者具有显著性差异(P0.01);实验组小鼠外周血Treg细胞水平在第7d、第14d及21d分别为1.84%±0.07%、2.46%±0.31%及3.23%±0.23%,对照2组外周血Treg细胞水平在第7d、第14d及21d分别为0.68%±0.05%、0.52%±0.04%及0.37%±0.08%,实验组小鼠外周血Treg细胞水平明显高于对照2组,两者具有显著性差异(P0.01);输注后d7天测各组小鼠细胞因子水平,其中对照1组和对照2组血清IL-2水平分别为(30.44±3.97)pg/ml及(42.33±7.94)pg/m L,对照1组小鼠血清IL-2低于对照2组,两者具有显著性差异(P0.01);对照1组和对照2组血清IFN-γ水平分别为(132.44±9.15)pg/ml及(153.22±6.96)pg/m L,对照2组小鼠血清IFN-γ高于对照1组,两者具有显著性差异(P0.01);对照1组和对照组2血清IL-4水平分别为(52.76±6.89)pg/ml及(39.33±2.12)pg/m L,对照1组小鼠血清IL-4水平高于对照2,两者具有显著性差异(P0.01);对照1组和对照2组血清IL-10水平分别为(68.11±3.48pg)pg/ml及(48.00±4.82)pg/m L,对照1组小鼠血清IL-10水平高于对照2组,两者具有显著性差异(P0.01);;实验组血清IL-2水平和对照2组相比显著降低(实验组:39.78±5.78pg/m L,t=2.50,P0.01);实验组IFN-γ的水平和对照2组相比显著降低(实验组143.67±9.18pg/m L,t=2.49,P0.01);实验组血清IL-4水平和对照2组相比显著升高(实验组42.22±2.91pg/m L,t=-2.83,P0.01);实验组IL-10水平和对照2组相比显著升高(实验组55.11±6.74pg/m L,t=-2.58,P0.01)。结论:1、全骨髓贴壁培养法是一种操作简单、高效的分离小鼠BM-MSCs方法,使骨髓作为一个细胞治疗可靠的来源,有利于MSCs基础与临床临用,值得进一步推广应用。2、成功建立了一种制备血小板自身抗体的一种简易方法,可用于对血小板发病机制及治疗的进一步研究。成功建立了一种ITP小鼠模型,该模型一定程度上模拟了ITP的发病机制,克服了其他方法造模的稳定性差及可能同时伴发其他免疫性疾病等的缺点,为进一步探讨ITP的治疗提供了良好的平台。3、BM-MSCs治疗可以升高ITP小鼠血小板水平,对小鼠ITP治疗具有一定的效果。其有效的治疗机制可能是由于BM-MSCs可调节Treg水平和抑制Th1细胞分泌促炎细胞因子,促进Th2细胞分泌抗炎细胞因子有关,调节Treg分化及Th细胞极化,提示MSCs有望成为难治性ITP治疗性新途径。BM-MSCs用于治疗ITP的详细分子机制还需要进一步的研究探讨,从而为MSCs治疗ITP奠定临床前治疗理论依据。
[Abstract]:Objective : To study the biological characteristics of bone marrow derived mesenchymal stem cells ( BM - MSCs ) in mice . The mice were divided into three groups : SCID mice control group 1 ( untreated group ) , control group ( ITP + BM - MSCs ) . The levels of anti - CD61 Ig G were ( 61.11 卤 6.16 ) 脳 109 / L , ( 608.56 卤 47.59 ) 脳 109 / L , ( 608.56 卤 47.59 ) 脳 109 / L , ( 608.56 卤 47.59 ) 脳 109 / L , ( 608.56 卤 47.59 ) 脳 109 / L , ( 604.38 卤 19.62 ) 脳 109 / L , respectively . The levels of Treg cells in the spleen of experimental group were significantly higher than those in control group ( P 0.01 ) . The levels of serum IL - 2 and IL - 4 in the control group were significantly lower than those in the control group ( P 0.01 ) . The levels of serum IL - 2 in the control group were ( 52.76 卤 9.15 ) pg / ml and ( 42.33 卤 4.82 ) pg / ml and ( 42.33 卤 4.82 ) pg / ml respectively . The levels of IL - 4 in the control group were significantly higher than those in the control group ( experimental group : 42.22 卤 2.91pg / ml , t = - 2.83 , P0.01 ) . Conclusion : 1 . The bone marrow adherent culture method is a simple and effective method for separating mouse BM - MSCs , which can be used as a reliable source for the treatment of ITP .
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R725.5;R-332

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