线粒体-NLRP3炎症小体对话在蛋白尿诱导肾小管上皮细胞损伤中的作用

发布时间：2018-06-24 18:17

本文选题：慢性肾脏病 + 蛋白尿　；参考：《南京医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：蛋白尿作为一种肾脏疾病的标志物,是肾小管上皮细胞及小管间质损伤的独立危险因素。肾小管间质损伤进一步促进肾脏疾病的进展,最终导致终末期肾功能衰竭。在过去几十年中,众多文献报道蛋白尿损伤肾脏的机制,如白蛋白引起肾小管上皮细胞表型转变以及白蛋白通过PKC-6调控细胞的凋亡。然而,白蛋白诱导肾脏损伤的具体机制尚不清楚,临床上对蛋白尿相关疾病也缺少有效的治疗方案。众多的临床观察和实验研究表明,不管肾脏疾病类型,严重的蛋白尿都是影响其病情进展和预后的最重要因素之一。因此,研究尿蛋白致肾脏损害的作用机理对延缓肾脏疾病的进展、保护肾功能有重要意义。肾小管上皮细胞在受到外界刺激时会损伤线粒体功能,这些刺激包括：遗传性线粒体细胞病、外界有毒生物及缺血再灌注损伤。线粒体是一种复杂的细胞内器官,参与许多代谢循环及信号转导包括能量的产生、活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生、钙离子平衡以及细胞凋亡途径的调控。Elif Erkan等报道在人近端肾小管上皮细胞中白蛋白诱导的凋亡与线粒体有关,但线粒体功能障碍是细胞凋亡的原因还是结果尚不清楚。炎症小体(inflammasome)作为细胞内信号平台,在炎症因子的表达及活化中发挥重要作用。炎症小体可被多种内源性物质刺激活化,如活性氧、尿酸钠结晶和钾离子流动等所活化,并介导2型糖尿病、动脉粥样硬化、痛风、阿尔茨海默病等代谢性和免疫性疾病的发病。在这些炎症小体中,对NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain containing3)炎症小体研究最多。NLRP3炎症小体基本结构单位是由NLRP3、接头蛋白ASC(apoptosis speck protein with CARD)和胱天蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease, caspase)-1组成,在静息状态下以无活性的形式存在于细胞内,当细胞受到特定刺激,NLRP3与ASC结合后招募pro-caspase-1,形成复合体,产生具有生物活性的caspase-1,即白细胞介素(interleukin,IL)-1p转化酶,后者作用于pro-IL-1β和pro-IL-18等炎症因子前体,继而产生具有致炎活性的IL-1p和IL-18,参与机体天然免疫应答及细胞损伤。由此可见,NLRP3炎症小体不仅可促进炎症因子的产生,还能促进炎症因子的活化,是局部炎症反应启动的中心环节。研究发现NLRP3炎症小体在肾损伤中发挥重要作用。在单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)[1及肾缺血再灌注(ischemia reperfusion injury, IRI)小鼠模型中,NLRP3基因敲除小鼠可阻断UUO及IRI引起的小管损伤和炎症反应。对人类肾脏疾病的研究也发现,在多种慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD),如IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎等,以及在急性肾损伤,如新月体性肾炎和急性肾小管坏死肾组织中NLRP3表达显著增加,且与肾功能密切相关。但在白蛋白负荷模型中,NLRP3炎症小体发挥的作用尚不明确。业已证实,线粒体功能障碍在NLRP3炎症小体活化中发挥重要作用,线粒体ROS及转位入胞浆的线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)均可诱导LRP3炎症小体活化。文献报道线粒体自噬可抑制NLRP3炎症小体的活化。线粒体线粒体抗病毒蛋白(mitochondrial anti-viral signaling protein, MAVS)可促进NLRP3炎症小体定位于线粒体,而NLRP3通过MAVS作用于线粒体,进一步完成活化过程。目前的文献报道都集中于线粒体功能对NLRP3炎症小体活化的影响,但NLRP3炎症小体活化对线粒体功能障碍的影响未见报道。蛋白尿作为肾脏疾病的标志物及独立危险因素,通过促进炎症因子的释放损伤肾小管,进而参与肾脏疾病的发生与发展。激活的NLRP3炎症小体促进炎症因子的释放,参与肾脏疾病的发展过程。目前仅有一篇文献报道蛋白尿可诱导NLRP3炎症小体活化。炎症因子作为蛋白尿与NLRP3炎症小体促进肾脏疾病的发展过程的共同途径,在蛋白尿相关的肾脏病中,其可能是蛋白尿与NLRP3炎症小体关系的纽带。我们推测NLRP3炎症小体在蛋白尿相关的肾脏病中发挥重要作用,其机制需进一步探讨。第一部分慢性肾脏病患儿肾组织中NLRP3表达及其与蛋白尿的关系目的：观察NLRP3在慢性肾脏病患儿肾组织中的表达。方法：慢性肾脏病患儿18例,男11例(61%),女7例(39%),平均年龄9岁6个月。病种分别为：紫癜性肾炎8例,IgA肾病3例,IgM肾病2例,狼疮性肾炎2例,局灶节段性肾小球硬化1例,膜性肾病1例,系膜增生性肾炎1例。按蛋白尿的程度将CKD患儿分为轻度蛋白尿组(尿蛋白1.0g/24h)6例、中度蛋白尿组(尿蛋白1-3g/24h)6例和重度蛋白尿组(尿蛋白3.0g/24h)6例。尿蛋白正常组(0-1g/24h)6例,其肾脏组织来源于肾脏肿瘤切除术后肿瘤周边肾组织。应用免疫组化检测活检肾组织中NLRP3的表达,并分析其与蛋白尿的相关性。结果：免疫组化染色结果显示CKD患儿的活检肾组织NLRP3表达量较正常肾组织明显增多,并且以重度蛋白尿患儿的活检肾组织NLRP3表达最强。NLRP3表达主要位于肾小管部位,肾小球部位未见表达。积分光密度(integrated optical density, IOD)统计值显示随着蛋白尿程度的加重,NLRP3的表达逐渐增加。对尿蛋白量与NLRP3的IOD值进行回归分析,结果显示NLRP3的表达与蛋白尿程度成正相关(r2=0.8215,P0.01)。结论：慢性肾脏病患儿肾组织中NLRP3表达显著增加,且NLRP3表达与蛋白尿程度呈正相关。第二部分NLRP3炎症小体活化在蛋白尿介导肾小管上皮细胞损伤中的作用目的：探讨NLRP3炎症小体活化在蛋白尿介导肾小管上皮细胞损伤中的作用。方法：体外培养小鼠肾近端小管上皮细胞(mouse proximal tubular epithelial cells,mPTCs),应用不同浓度的白蛋白(2、5、10、20g/ml)刺激不同的时间(2、4、8、12、24、48h)。体内研究中,对NLRP基因敲除(NLRP3-/-)小鼠通过腹腔注射白蛋白构建白蛋白负荷小鼠模型,分为四组：野生型对照组,野生型白蛋白组,NLRP3-/-对照组,NLRP3-/-白蛋白组,于第12天处死小鼠,检测PAS染色后光镜下肾组织病理形态学改变、电镜下肾组织微观结构改变、肾小管损伤及NLRP3炎症小体活化相关指标。同样,对caspasel基因敲除(caspasel-/-)小鼠,应用相同的方法制备白蛋白负荷实验模型并进行分组。应用real-time PCR和western blot检测肾小管上皮细胞E-cadherin、a-SMA、vimentin及NLRP3炎症小体活化后相关指标(NLRP3、caspase1、IL-1β及IL-18)的表达；应用Hoechst染色及Annexin V-PI双染流式细胞术检测体外培养的肾小管上皮细胞凋亡；应用TUNEL检测肾组织中肾小管上皮细胞凋亡。结果：(1)白蛋白呈剂量及时间依赖性地诱导肾小管上皮细胞的损伤,表现为mPTC的凋亡及表型转化,包括E-cadherin的表达下降,α-SMA及vimentin的表达增多。流式细胞术结果显示不同剂量的白蛋白刺激mPTC24h,5mg/ml白蛋白开始诱导(?)PTC凋亡(8%),20mg/ml白蛋白诱导rmPTC凋亡达11.5%。核酸与蛋白水平结果显示白蛋白处理mPTC12h,白蛋白显著诱导E-cadherin下降,α-SMA及vimentin增加。(2)NLRP3炎症小体的活化也与白蛋白呈剂量及时间依赖性的关系,表现为白蛋白呈剂量及时间依赖性地诱导NLRP3、 caspase1、IL-1β及IL-18的表达增多。10mg/ml白蛋白刺激mPTC8h后,NLRP3炎症小体开始活化,早于白蛋白诱导的mPTC损伤(12h),提示白蛋白可能通过激活NLRP3炎症促进mPTC损伤。(3)NLRP3siRNA阻断NLRP3炎症小体的活化,表现为NLRP3siRNA阻断白蛋白诱导的caspase1、IL-1β及IL-18的增多；同时,NLRP3siRNA抑制白蛋白诱导的mPTC损伤,表现为Hocehest染色及Annexin V-PI双染流式细胞仪检测结果显示NLRP3siRNA抑制白蛋白诱导的(?)PTC凋亡；核酸及蛋白水平结果提示NLRP3siRNA抑制白蛋白诱导的E-cadherin下降,α-SMA及vimentin的增多；体内实验显示,NLRP3及caspasel基因敲除的白蛋白负荷小鼠肾小管损伤较野生型白蛋白小鼠明显好转,表现为PAS染色后,光镜下观察,基因敲除的白蛋白负荷组较野生型白蛋白组刷状缘脱落以及小管萎缩明显减少；电镜下,基因敲除的白蛋白负荷组肾小管维持完整的刷状缘；TUNEL染色结果显示,基因敲除的白蛋白负荷组较野生型白蛋白组肾小管细胞凋亡显著减少；核酸及蛋白水平结果显示,基因敲除的白蛋白负荷组较野生型白蛋白组,E-cadherin表达上升,a-SMA与vimentin的表达下降。同时,NLRP3-/-及caspase1-/-抑制白蛋白负荷模型诱导的NLRP3炎症小体的活化。表现为NLRP3下游分子caspase1、IL-Iβ及IL-18表达水平的下降。结论：白蛋白通过活化NLRP3炎症小体诱导肾小管上皮细胞损伤。第三部分线粒体功能障碍在蛋白尿诱导NLRP3炎症小体活化中的作用目的：探讨线粒体功能障碍在蛋白尿诱导NLRP3炎症小体活化中的作用。方法：体外培养肾小管上皮细胞,应用不同浓度的白蛋白(2、5、10、20g/m1)刺激不同的时间(2、4、8、12、24、48h),或应用MnTBAP (100μM)、CsA (0.5μg/ml)预处理肾小管上皮细胞30min。通过腹腔注射白蛋白构建白蛋白负荷小鼠模型,129系小鼠18只,随机分为3组：正常组、白蛋白负荷模型组组、MnTBAP干预组,于第12天处死小鼠。采用荧光探针DCHFDA染料检测细胞内ROS的产生；荧光素酶法检测细胞内ATP含量；流式细胞术检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP);通过RT-PCR检测tDNA拷贝数的变化；应用western blotting检测细胞色素C的释放,电镜检测肾小管线粒体形体的改变。应用real-time PCR和western blot检测肾小管上皮细胞E-cadherin、a-SMA、vimentin及NLRP3炎症小体活化相关指标(NLRP3、 caspase1、IL-1β及IL-18)的表达；应用Hoechst染色及Annexin V-PI双染流式细胞术检测体外培养的肾小管上皮细胞凋亡；应用TUNEL检测肾组织中肾小管上皮细胞凋亡；PAS染色光镜下观察肾组织形态学改变,电镜下肾组织微观结构改变、肾小管损伤。结果：(1)白蛋白呈剂量依赖性地诱导线粒体ROS生成、MMP下降、ATP合成以及mtDNA拷贝数减少。白蛋白浓度在为5mg/ml时即开始有影响,20mg/ml时影响最大(增加320%,P0.01)。(2)应用10mg/ml白蛋白刺激mPTC不同时间,刺激30min时,ROS生成量显著增加(增加310%,P0.01),1h时ROS生成最多(增加487%,P0.01),且ROS维持4h。白蛋白刺激8h起,MMP显著下降(下降49%,P0.01),ATP合成及mtDNA拷贝数也显著减少。而白蛋白诱导mPTC的损伤仅在白蛋白持续刺激mPTC24h时才出现,提示白蛋白诱导的线粒体功能障碍早于mPTC损伤。(3)MnTBAP及CsA阻断白蛋白诱导的mPTC损伤,表现为MnTBAP及CsA抑制mPTC凋亡及抑制mPTC表型转换；同时,MnTBAP及CsA阻断线粒体功能障碍,表现为MnTBAP及CsA抑制ROS的产生,恢复MMP、ATP合成与mtDNA拷贝数。体内实验显示,MnTBAP干预组肾小管损伤较白蛋白组显著好转,表现为MnTBAP干预组较白蛋白组,光镜下刷状缘脱落及小管萎缩明显减少；电镜下维持完整的肾小管刷状缘；肾小管细胞凋亡明显减少；E-caderin表达上升,a-SMA与vimentin的表达下降。同时,MnTBAP干预组较白蛋白组,线粒体功能障碍显著缓解,表现为电镜下白蛋白组线粒体嵴消失,线粒体肿大,而MnTBAP干预组线粒体形态正常；MnTBAP干预组较白蛋白组,从线粒体释放到胞浆的细胞色素C显著减少；mtDNA拷贝数及ND1与ATP合酶表达量明显增多。(4)在体外培养的肾小管上皮细胞中,MnTBAP及CsA阻断白蛋白诱导的NLRP3炎症小体活化,表现为NLRP3表达下降,caspase1、IL-1β及IL-18成熟体表达也减少。MnTBAP干预组小鼠NLRP3炎症小体活化被抑制,与上述体外实验结果一致。(5)NLRP3siRNA阻断白蛋白诱导的肾小管上皮细胞线粒体功能障碍,表现为线粒体ROS生成减少、MMP升高、ATP水平上升以及atDNA拷贝数增多。NLRP3-/-及caspasel-/-白蛋白负荷组较野生型白蛋白负荷组,线粒体功能障碍明显好转,表现为电镜下野生型白蛋白负荷组线粒体嵴消失,线粒体肿大,而NLRP3-/-及caspasel-/-白蛋白负荷组线粒体形态正常；NLRP3-/-及caspasel-/-白蛋白负荷组较野生型白蛋白负荷组,从线粒体释放到胞浆的细胞色素C显著减少,mtDNA拷贝数及ATP合酶表达量明显增多。结论：白蛋白通过线粒体功能障碍激活NLRP3炎症小体,从而损伤mPTC；抑制NLRP3炎症小体的活化可阻断线粒体功能障碍。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R726.9

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