PinlshRNA慢病毒载体构建及其对高氧诱导人肺泡上皮细胞凋亡的影响

发布时间：2018-07-03 06:56

本文选题：Pin1 + 慢病毒载体　；参考：《泸州医学院》2014年硕士论文

【摘要】：目的：Pin1是人类肽基脯氨酰异构酶，现在主要用于研究抑制肿瘤细胞的靶点。而目前研究发现，Pin1参与氧化应激通路，抑制其表达将可能减少高氧肺损伤，但具体作用机制研究鲜有报道。RNAi技术是目前公认能够快速有效的基因沉默方式，其可高效、特异性下调目标基因的表达，研究基因功能和信号转导途径，越来越受到人们的关注。本实验拟构建Pin1shRNA慢病毒载体，建立稳定抑制肽基脯氨酰顺反异构酶（Pin1）表达的A549细胞系，从而探讨Pin1在氧化应激通路介导高氧诱导人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞凋亡的作用。方法：根据查阅文献获得Pin1shRNA干扰靶点序列并插入pLenR-GPH载体，构建pLenR-GPH-Pin1shRNA慢病毒载体，随后转入人胚肾HEK293T细胞中,收集其上清进行病毒滴度测定，再行慢病毒的包装，将获得的慢病毒毒液感染A549。通过实时定量PCR（qRT-PCR）及Western blot法检测Pin1在不同组的表达抑制情况，最终获得稳定抑制Pin1表达的A549-Pin1shRNA细胞系。随后将实验分为四组：空气组、高氧组、空载体组以及A549-Pin1shRNA高氧组。高氧组、A549-Pin1shRNA高氧组及空载体组均以高体积分数氧（高氧）诱导细胞，即通入3L/min的90%氧气和5%二氧化碳高纯混合气10min，并在培养箱中密培养24h。空气组则是含有10%胎牛血清和1%青链霉素的1640培养基中常规培养。培养结束后收集细胞进行以下检测:倒置相差显微镜下观察各组细胞的形态学改变；流式细胞术检测各组细胞在高氧诱导下凋亡率的影响；采用SP细胞免疫化学方法检测各组细胞中Caspase-9、 XIAP蛋白的表达;荧光显微镜检测各组细胞线粒体活性氧簇产生的情况以及荧光显微镜检测各组细胞线粒体膜电位的变化。结果：(1)经限制性内切酶鉴定及测序分析，成功构建了pLenR-GPH-Pin1shRNA慢病毒载体质粒,包装并得到高滴度的病毒颗粒。通过qRT-PCR和Western blot检测显示，与对照组相比，转染pLenR-GPH-Pin1shRNA慢病毒载体感染的A549细胞中Pin1的表达在mRNA和蛋白两个水平均有所下降，成功构建了A549-Pin1shRNA细胞系。(2)在倒置显微镜下，常规培养的细胞生长状态良好，活细胞数量较多，少见细胞漂浮，细胞呈梭形，细胞间隙较小，连接紧密。高氧组及空载体组细胞均呈现出生长状态差，活细胞明显较常规培养减少，培养基中可见大量圆形细胞漂浮，剩下的活细胞排列松散，间隙明显增宽。而A549-Pin1shRNA高氧组生长状态欠佳，活细胞数量较高氧组及空载体多，悬浮细胞数较高氧组及空载体组少，但未达到空气组水平；(3)流式细胞术结果显示：高氧组与空载体相比，细胞凋亡率相近，差异不具有统计学意义（P0.05）。高氧组、空载体与空气组相比，细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义（P0.05）；而A549-Pin1shRNA高氧组的凋亡率有所降低，其值介于高氧组与空气组之间，与高氧组、空气组相比差异有统计学意义（P0.05）;(4)免疫组化结果显示，高氧组与空载体在Caspase-9、 XIAP蛋白表达无明显差异（P0.05），其二者与空气组相比，Caspase-9蛋白表达明显增加，XIAP蛋白明显降低，差异有统计学意义（P0.05）。在A549-Pin1shRNA高氧组中的表达Caspase-9、 XIAP蛋白表达量介于高氧组与空气组之间，差异有统计学意义（P0.05）。(5)荧光显微镜检测各组细胞中线粒体活性氧簇产生的情况：线粒体活性氧簇染色成红色荧光，细胞核染成蓝色荧光。空气组红色荧光表达微弱。而高氧组及空载体组细胞红色荧光表达二者之间无明显差异（P0.05），，但与空气组对比，其ROS的荧光表达明显增加，差异有显著性（P＜0.05）；A549-Pin1shRNA高氧组红色荧光含量较高氧组有所减少，差异有显著性（P＜0.05），但未减少至空气组水平（P＜0.05）。(6)荧光显微镜检测各组细胞线粒体膜电位的变化：与空气组相比，高氧组及空载体组线粒体膜电位均明显下降，差异有显著性（P＜0.05），而在高氧组及空载体组二者之间膜电位下降无明显差异（P0.05）；与高氧组相比A549-Pin1shRNA高氧组线粒体膜电位升高，差异有显著性（P＜0.05），但仍未达到空气组水平（P＜0.05）。结论：1、成功构建Pin1shRNA慢病毒载体其高效感染体外培养的人肺泡上皮细胞A549，构成稳定A549-Pin1shRNA细胞系，并可显著抑制Pin1在mRNA和蛋白水平的表达。2、在高氧环境下能够诱导细胞内PKCβ表达增多，从而Pin1表达也有所增多,Pin1能够介导p66shc发生磷酸化,使其转位于线粒体,最终导致线粒体活性氧产生增多，线粒体膜电位下降。通过抑制Pin1的表达，减少线粒体ROS的产生，减轻△Ψ m下降，减少细胞凋亡及Caspase-9的产生，增加XIAP，从而减轻高氧诱导的人肺泡上皮细胞的损伤，有望成为高氧肺损伤新的治疗途径。
[Abstract]:Objective : Pin1 is a human peptide - based proline isomerase , which is mainly used to study the target of inhibiting tumor cells .

Methods : Pin1shRNA interfering target sequence was obtained and inserted into pLenR - GPH vector to construct pLenR - GPH - Pin1shRNA lentivirus vector , then transferred into human embryo kidney - bearing 293 cells .
Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of each group in high oxygen - induced apoptosis .
The expression of Caspase - 9 and XIAP protein in each group was detected by SP cell immunochemistry method , and the changes of mitochondrial membrane potential in each group were detected by fluorescence microscope .

Results : ( 1 ) The expression of Pin1 in A549 cells infected with pLenR - GPH - Pin1shRNA lentivirus vector was successfully constructed by restriction endonuclease identification and sequencing .
( 3 ) Flow cytometry showed that the apoptosis rate was similar between high oxygen group and empty vector ( P0.05 ) .
Compared with air group , the expression of Caspase - 9 and XIAP decreased significantly ( P0.05 ) . Compared with air group , the expression of Caspase - 9 and XIAP decreased significantly ( P0.05 ) .
Compared with air group , the mitochondrial membrane potential of A549 - Pin1shRNA high oxygen group decreased significantly ( P < 0.05 ) , but there was no significant difference between the high oxygen group and the empty carrier group ( P < 0.05 ) .
Compared with hyperoxia group , the mitochondrial membrane potential of A549 - Pin1shRNA high oxygen group increased significantly ( P & lt ; 0.05 ) , but the air group level was still not reached ( P & lt ; 0.05 ) .

Conclusion : 1 . Pin1 shRNA lentivirus vector is successfully constructed to infect human alveolar epithelial cells A549 . It is a stable A549 - Pin1shRNA cell line , which can significantly inhibit the expression of Pin1 in mRNA and protein levels .
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R722

【参考文献】