天贝汤对支气管哮喘大鼠气道炎症和气道重塑的影响的实验研究

发布时间：2018-07-18 13:06

【摘要】：目的：支气管哮喘（bronchial asthma，简称哮喘）是以气道炎症、气道重塑、可逆性气道阻塞、气道高反应性为主要特征的由多种因素引起的一种气道慢性炎症性疾病，是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞参与的一种呼吸系统疾病。近二十年来，随着工业化和全球污染的加剧，在世界范围内哮喘的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，全球患者约3亿左右，严重威胁着人们的身体健康和生存质量。加之哮喘病程绵长难愈，给社会带来了严重的经济负担。所以，哮喘已成为严重的公共卫生问题而引起了世界各国的极大关注。到目前为止，全身或局部应用糖皮质激素仍然是治疗哮喘的首选，但长期应用副作用明显。中医中药防治哮喘应该受到重视，特别是在减少副作用，预防复发等方面与西药比较有一定的优势。本文还概述了历代中医学家对哮喘的病名、病因病机、辨证施治的认识，对中药及中医药治疗哮喘的现代临床与机理研究作了全面总结。阐述了哮喘的现代流行病学、病因病机等。天贝汤是导师郭振武教授的临床经验方，具有宣肺降气、化痰平喘之功。本课题在建立大鼠支气管哮喘模型的基础上，予天贝汤进行干预，通过对本动物实验的观察，选择与哮喘发病机制相关的多项指标，探讨天贝汤对支气管哮喘大鼠气道炎症和气道重塑的作用和机制，为中医中药临床治疗支气管哮喘提供理论依据。材料与方法：72只健康雄性SPF级Wistar大鼠，体重240±20g，实验动物许可证号SCXK(京)2009-0004，随机分为正常对照组、哮喘模型组、天贝汤高剂量组（以下简称为高剂量组）、天贝汤中剂量组（以下简称为中剂量组）、天贝汤低剂量组（以下简称为低剂量组）、小青龙对照组（以下简称为小青龙组），每组12只。天贝汤组成：麻黄、茯苓、清半夏、川贝、天麻等组成，小青龙胶囊组成：麻黄、白芍、细辛、干姜、炙甘草、桂枝、半夏、五味子。将上方加水煎煮三次合并后过滤。低温(4℃)放置备用。天贝汤高、中、低剂量组，给药剂量分别是：高剂量组9ml/kg,中剂量组4.5ml/kg，低剂量组2.25ml/kg，小青龙组给药剂量0.972g/kg。从第15天开始给药，直至处死，每日1次灌胃，连续6周。各组参照吕国平等介绍的方法，分为致敏和激发两步。除正常对照组外，实验第1d和第8d共2次每只大鼠腹腔注射新鲜配制的含10%卵蛋白的生理盐水1ml（内含卵蛋白100mg，氢氧化铝100mg和灭活百日咳杆菌6×109个）致敏，致敏15d后各组灌胃后1小时后将大鼠放入不完全封闭的雾化吸入箱内开始激发，用超声雾化器喷入含1%卵蛋白激发，每次雾化20分钟，每日1次，激发6周，激发后以大鼠烦躁、打喷嚏、咳嗽、抓鼻、大小便失禁、呼吸幅度加深及喘促发作、紫绀等哮喘发作症状，认为哮喘造模成功。正常对照组以生理盐水代替卵蛋白进行腹腔注射及雾化吸入，雾化流量及时间同前。第一部分天贝汤对支气管哮喘大鼠支气管病理组织学观察末次喷雾激发后18-24h内予乙醚麻醉动物，以固定板固定后打开并暴露胸腔，开胸结扎，剥离肺组织，取出肺组织，于4℃4%多聚甲醛固定，脱水、包埋、切片，HE染色观察。第二部分各组大鼠体重和被激发时的表现的变化第三部分天贝汤对支气管哮喘大鼠肺组织核因子-κB（NF-κB）的影响核因子-κB（NF-κB)是一种具有多种功能的核转录因子，具有广泛的生物学活性，不仅参与哮喘的气道炎症反应，还参与哮喘气道重塑的过程。动物分组、模型建立、用药情况及数据统计处理同前。动物麻醉完全后，取肺组织于4%多聚甲醛固定，脱水、包埋、切片，行免疫组织化学ABC法染色。一抗选用兔抗p52(N F-кB的一个亚单位)多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司)稀释度1∶100;用SABC法试剂盒进行操作,操作步骤按试剂盒说明书进行。主要操作步骤如下：石蜡切片常规脱蜡脱水，3%H2O2溶液灭活内源性过氧化物酶，热修复1h。滴加山羊封闭血清，湿盒孵育，加入一抗（1:100稀释）湿盒孵育1h，4℃冰箱内过夜，PBS漂洗，加入生物素化二抗37℃孵育，PBS漂洗5min，3次。⑧滴加ABC复合物37℃孵育30min，PBS漂洗5min，3次。⑦二氨基联苯胺(DAB)光镜下显色5-15min，终止呈色反应。苏木精衬染，常规裱片、封片和观察。计算机图象处理软件半定量测定NF－κB表达。第四部分天贝汤对支气管哮喘大鼠血清中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）的影响。气道重塑是慢性哮喘反复发作的重要病理生理基础，它与哮喘肺功能损害及气道高反应性密切相关。细胞外基质(ECM)的沉积和降解的失衡是导致气道壁结构异常、间质增生和肺实质破坏的重要原因，ECM主要由基质金属蛋白酶（MMPs）来降解,其中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是锌依赖性蛋白酶，MMP-9催化集团区含有3个重复的类Ⅱ型纤维连接蛋白结合区，决定了它对明胶和弹力纤维的底物特异性，主要降解Ⅳ型以及Ⅴ型胶原。近来研究表明MMP-9在支气管哮喘患者的气道炎症和气道重塑中发挥重要作用。动物分组、模型建立、给药情况及数据统计处理同第一部分。动脉血血清中MMP-9、TIMP-1含量检测：采用双抗体夹心法ABC-ELISA法测定MMP-9、TIMP-1含量，具体方法如下。 ①建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中加入样品稀释液100μl，第一孔加入标准品100μl，混匀后用加样器吸出100μl，移至第二孔，如此反复行对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100μl弃去，使之体积为100μl，第八孔为空白对照。 ②加样：待测样品孔中每孔加入待测样品100μl。 ③将反应板充分混匀后放置37℃120分钟。 ④洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。 ⑤每孔中加入第一抗体工作液50μl，将反应板充分混匀后置37℃60分钟。 ⑥用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。 ⑦每孔加酶标抗体工作液100μl，将反应板置37℃60分钟。 ⑧用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次。每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处反应5-10分钟。每孔加入1滴终止液混匀，在492nm处测吸光值。以标准品2000、500、250、125、62、31、0ng/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线，根据样品OD值在该标准曲线上查出MMP-9的含量，TIMP-1方法同MMP-9。第五部分天贝汤对支气管哮喘大鼠肺组织表面相关凋亡基因蛋白Fas和Bcl-2表达的影响动物分组、模型建立、用药情况及数据统计处理同前。动物完全麻醉后，取肺组织，加入Trizol充分匀浆，提取总RNA，采用RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中相关凋亡基因蛋白Fas和Bcl-2表达的变化。统计学方法：数据采用均数±标准差（—x±s)表示，用SPSS统计软件处理，统计方法采用单因素方差分析及LSD检验。显著差异水平以0.05和0.01为标准。结果： 1.天贝汤对哮喘大鼠支气管-肺组织病理学的影响肺组织肉眼形态观察:正常对照组:肺组织颜色淡红，肺组织柔软而富有弹性，表面光滑。哮喘模型组:肺组织过度膨胀，部分肺组织颜色变深，呈暗红色，质地稍硬，表面有呈颗粒状的瘀点。天贝汤各剂量组和小青龙组肺组织颜色稍暗，膨胀不明显，无瘀斑瘀点。光镜观察：正常对照组：大鼠支气管内及其周围无明显的炎性细胞浸润，支气管壁完整光滑，细胞排列规整，平滑肌层厚度正常，支气管粘膜规整，管腔内无脱落上皮细胞。模型组：支气管管壁及伴行的动脉周围有大量嗜酸性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，管腔内容物增多，微血管渗漏，可见管腔内炎性分泌物增多，有的小支气管甚至被粘液栓及炎性细胞所堵塞。杯状细胞增生，气道上皮指状增生，平滑肌层增厚，排列紊乱，支气管粘膜水肿增厚，上皮脱落，上皮下纤维化，支气管粘膜皱壁增多、延长。高剂量组：嗜酸性粒细胞及淋巴细胞等炎性细胞浸润明显减少，几乎消失，水肿明显消失，管壁和平滑肌层厚度接近正常对照组,逐渐恢复，支气管粘膜规整，支气管管腔内偶见脱落上皮细胞及粘液。中剂量组：嗜酸性粒细胞及淋巴细胞等炎性细胞浸润有所减少，管壁和平滑肌层厚度有所减少，气管管壁结构层次清楚，支气管管腔内偶见脱落上皮细胞及黏液，管腔渗出物逐渐吸收。低剂量组：支气管周围嗜酸性粒细胞及其他炎性细胞浸润略微减少，管壁和平滑肌层厚度略减少，管腔内偶见脱落上皮细胞及黏液。小青龙组：黏膜下层见轻度充血水肿及少量炎症细胞，管腔内见炎性渗出物，粘膜增生，支气管腔内少量脱落细胞和粘液。 2.各组大鼠体重和被激发时的表现的变化体重：激发后各组大鼠体重均增。空白组大鼠体重与其余各组有差异，高于其余各组(p0.01)；高、中、低剂量组，小青龙组及模型组之间无统计学意义(p0.05)。被激发时的表现：空白组大鼠表现活泼好动，动作灵敏，毛色光滑，呼吸平稳。模型组大鼠在吸入OVA后不久即出现过敏症状如：躁动不安，搔抓、舔肢体、打喷嚏等，继而大鼠反应迟钝，出现呼吸急促，呼吸困难(明显的腹式呼吸)，伴轻度紫绀，部分大鼠可闻及响亮的呼气相喘鸣音和不规则呼吸。与哮喘模型组比较，高、中剂量组症状减轻，无呼吸急促，无紫绀，无呼气相喘鸣音；低剂量组和小青龙组呼吸稍急促，无紫绀，喘鸣音减轻。在高中低剂量组比较中，高剂量组较低剂量组比较有明显好转，没有呼吸急促和呼吸困难症状，大鼠毛色光泽较好，精神也较好。 3.对哮喘大鼠支气管NF－κB表达的影响与正常对照组比较，模型组NF－κB表达明显增加，差异具有显著性意义（P0.01）。与模型组比较，NF－κB在各治疗组阳性表达减少，高剂量组降低最明显（P0.01），其次为中剂量组、小青龙组、小剂量组；与小青龙组对比，高剂量组NF－κB含量低，二者差异具有显著意义龴p0.01㖞。 4.对支气管哮喘大鼠动脉血清中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、组织基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的影响。与正常对照组相比，，模型组大鼠MMP-9、TIMP-1含量明显升高，差异具有显著性意义龴p0.01㖞，证明哮喘模型建立成功；与模型组比较，各治疗组MMP-9含量均降低，高剂量组降低最明显龴p0.01㖞，其次为中剂量组、小青龙组，低剂量组次之。与小青龙组相比，高剂量组含量低，二者差异具有显著意义龴p0.01㖞。 5.对支气管哮喘大鼠相关基因蛋白Fas mRNA、Bcl-2mRNA表达的影响。与正常对照组比较，模型组Bcl-2mRNA表达明显增多(P㩳0.01)，Fas mRNA表达明显减少龴p0.05㖞；与模型组比较，各治疗组Bcl-2mRNA表达减少，高剂量组减少最明显龴p0.01㖞，其次为中剂量组、小青龙组、小剂量组，与小青龙组比较高、中、低剂量组无统计学意义；与低剂量组比较，高剂量组Bcl-2mRNA表达强度低，二者差异具有显著意义龴p0.05㖞。与模型组比较，Fas mRNA在各治疗组表达有所增多,高剂量组增多最明显龴p0.05㖞，其次为中剂量组、小青龙组、小剂量组，但均无统计学意义；与小青龙组比较高、中、低剂量组均无统计学意义。与低剂量组比较，高、中剂量组、小青龙组均无统计学意义。结论： 1.哮喘发病与痰、风等致病因素有关。风盛痰阻、气道挛急是哮喘发作的主要病机，治疗以宣肺降气、化痰平喘及调理脏腑并举。 2.天贝汤具有宣肺降气、化痰平喘及调理脏腑的作用，对哮喘有确切的治疗作用。 3天贝汤治疗哮喘的作用机制 3.1对气道重塑的影响。对支气管-肺组织病理学观察结果显示，模型组支气管粘膜上皮部分脱落，黏膜下层充血水肿，嗜酸性粒细胞等炎细胞浸润，黏膜下平滑肌显著增生肥厚。与正常对照组相比，模型组出现气道重塑。经天贝汤治疗后，气管管壁结构逐渐恢复，炎症明显减轻，水肿明显消失，增生的平滑肌细胞基本恢复正常。提示天贝汤具有抑制哮喘豚鼠气道重塑，从而发挥平喘作用。其机制可能是通过减少气道EOS浸润，减少炎症介质分泌、释放，减轻炎性细胞渗出，抑制杯状细胞和平滑肌细胞增生，从而减轻气道炎症反应，抑制气道重塑。 3.2天贝汤能降低支气管哮喘大鼠肺组织中NF－κB的含量，从而从细胞因子角度解释天贝汤对气道炎症的抑制作用。 3.3天贝汤抑制气道重塑和细胞外基质沉积的作用可能与其降低动脉血清中MMP-9、TIMP-1含量有关。 3.4天贝汤抑制气道炎症和气道重塑的作用可能与其降低肺组织中Bcl-2mRNA表达，增加Fas mRNA表达有关。 4.天贝汤对实验性哮喘大鼠的平喘作用，具有剂量依赖关系，并且部分优于经典方剂小青龙汤，其机制有待于进一步深入研究。天贝汤通过多途径、多层次、多靶点抑制气道炎症和气道重塑，具有广阔的应用前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R285.5;R272

【引证文献】