婴幼儿血管瘤病程相关microRNAs的筛选和作用研究

发布时间：2018-11-05 08:25

【摘要】：婴幼儿血管瘤（Infantile hemangiomas，IH）是婴幼儿最常见的软组织肿瘤，高加索人种发病率在4-12%之间，亚洲人种发病率在1%左右，女婴相对高发，男女比例为1：3-4，早产低体重儿发病率明显升高。婴幼儿血管瘤一般在出生后数天或数周内即进入增生期表现为瘤体快速增殖，持续数周或数月后转入平台期，随后进入数年缓慢自发性的消退期，这种自然病程是IH的重要特征。虽然多数患儿的瘤体能够消退完全，但多留有疤痕或脂肪沉积样改变，增生早期对瘤体的控制能够减少残留面积，，同时约60%的IH瘤体发生于具有重要美学和生理功能的面颈部，以及仍有约20%的婴幼儿血管瘤因其显著的生长性，或者侵犯、影响正常生理功能甚至威胁婴幼儿生命而需要临床及时治疗，因尚无法预判患儿瘤体发展是否存在风险并需要特殊治疗，故IH的早期干预治疗越来越受到重视。但IH的具体发病机制仍然不明，临床治疗带有一定的盲目性，因此IH的机制研究成为必要。目前的研究倾向于IH来源于婴幼儿血管瘤干细胞，具有未分化性表面标记物的不成熟血管内皮细胞的大量增殖，是婴幼儿血管瘤增殖期快速生长的关键原因。多项研究表明VEGFR2信号通路的高活性状态对IH增生期的血管内皮细胞的增殖和迁移中起到了关键的作用，而NF-kB信号通路，Notch信号通路对IH的影响与VEGF信号通路活性的增强有密切的联系，临床广泛使用的糖皮质激素和普萘洛儿治疗IH的机制研究也与VEGF信号通路活性密切相关。IH临床表现为增生期、平台期和消退期，机制研究发现平台期是一种过度状态，是IH瘤体主要增殖细胞血管内皮细胞逐渐停止增殖，并逐渐消失伴随脂肪和纤维组织沉积的过度状态。关于IH消退的多项研究发现凋亡在其中具有重要作用，同时干细胞向脂肪细胞的分化和沉积可能也是消退的重要原因。但作为转录后调节的重要调节因子microRNA在IH中的研究尚未见文献报道。因此本课题旨在从microRNA在婴幼儿血管瘤发生发展中的作用出发，对IH的病程发展机制进行了进一步的研究，为更有效的指导临床治疗提供理论依据。本课题主要研究了以下内容：第一部分：不同时期婴幼儿血管瘤组织差异microRNA的芯片检测和筛选过Affymetrix miRNA3.0芯片对典型增生早期，平台期和消退期3例IH标本的microRNA进行检测，并通过miRanda数据库和Targetscan数据库分析预测靶基因，在取两者交集作为靶基因后，对基因进行功能分析，筛选和IH相关功能基因构建microRNA与靶基因的调控网络。对获取的不同时期IH组织标本共9例，增生早期4例，平台期3例，消退期2例，抽提总RNA后进行反转录，设计hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-130b-3p，hsa-miR-206，hsa-miR-371a-5p，hsa-miR-373-3p，hsa-miR-455-5p茎环状引物，采用SuperReal PreMix（SYBRGreen）试剂进行realtimePCR实时定量检测。实验所得数据以2-ΔΔCT进行量化分析。实验结果三例标本芯片检测结果进行两两比较，差异倍数以3倍及以上作为差异microRNA入选标准，共获得差异microRNA有38个，依疾病进程下调的microRNA共22个，上调microRNA共16个。获得这些差异microRNA的预测靶基因共2463个，基因功能GO-Analysis后，以IH疾病可能相关功能筛选得靶基因共540个，以此构建的microRNA与基因的调控网络显示处于调控网络中心的microRNA为：hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-130b-3p，hsa-miR-206，hsa-miR-371a-5p，hsa-miR-373-3p，hsa-miR-455-5p。9例标本抽提总RNA质检合格，各microRNA引物设计符合要求，realtimePCR结果显示，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-206，hsa-miR-455-5p组间存在统计学差异，hsa-miR-130b-3p，hsa-miR-371a-5p，hsa-miR-373-3p组间无统计学差异。第二部分：婴幼儿血管瘤来源血管内皮细胞的培养和鉴定实验方法：获取经确诊的IH增生早期手术后标本，消毒处理后第一时间于4℃条件下以分散酶作用24h，去除表皮碎化组织后以胶原酶于37℃下作用40min，随后进行细胞过滤，过滤后单细胞悬液以CD31偶联磁珠结合后经磁珠分选仪分选。分选后细胞以人脐静脉内皮细胞为对照，进行细胞生长曲线测定，细胞吞脂实验、血管内皮细胞成管实验、CD31和vWF抗体进行细胞免疫荧光染色实验进行细胞鉴定。实验结果：IH血管内皮细胞分选条件良好，可获得较充分的细胞量，分选后细胞生长状态良好，增殖能力自培养第三天后较人脐静脉内皮细胞增长更快；细胞吞脂实验显示与人脐静脉内皮细胞无明显差异；成管实验显示与人脐静脉内皮细胞比较，IH来源血管内皮细胞具备更快的成管能力，但成管较为杂乱；细胞免疫荧光染色显示IH来源血管内皮细胞CD31和vWF抗体阳性，所培养细胞阳性率在92±3%。第三部分：hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-206，hsa-miR-455-5p对婴幼儿血管瘤来源内皮细胞的作用研究实验方法：以fam荧光标记miR-67为转染对照，单纯转染试剂为阴性对照，通过转染试剂将hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-206，hsa-miR-455-5p的mimics或inhibitor转染入IH来源血管内皮细胞，通过cck-8法检测细胞活性反映细胞增殖能力改变，流式细胞仪检测细胞凋亡水平改变，transwell侵袭系统检测细胞侵袭能力改变，研究转染前后目的microRNA对IH来源内皮细胞增殖、凋亡与侵袭能力的影响。实验结果：fam荧光标记miR-67显示转染条件良好，转染效率近100%；和对照组比较，细胞转染hsa-miR-29a-3p的mimics后48h增殖能力无明显改变，转染后48h出现明显细胞凋亡，转染24h后侵袭能力无明显改变，细胞转染hsa-miR-29a-3p的inhibitor后48h细胞增殖凋亡与侵袭能力无明显改变；和对照组比较，细胞转染hsa-miR-206的mimics后48h增殖能力明显减弱，转染后48h出现明显细胞凋亡，转染24h后侵袭能力明显减弱，细胞转染hsa-miR-206的inhibitor后增殖与细胞凋亡无明显改变，细胞侵袭能力明显增强；和对照组比较，细胞转染hsa-miR-455-5p的mimics和inhibitor后48h增殖能力无明显改变，转染后48h无明显细胞凋亡，转染24h后侵袭能力无明显改变。本课题研究结论miR-29a-3p，miR-206，miR-455-5p在IH不同时期的microRNA表达谱中存在差异，这些差异miRNA可能参与了IH病程进展多种相关功能调节； miR-29a-3p可能通过改变IH血管内皮细胞的凋亡水平影响疾病进程，特别是对IH的自发消退起到了重要的转录后调节作用；miR-206可能通过改变IH血管内皮细胞的增殖能力、凋亡水平和侵袭能力影响IH病程发展变化，在IH自发消退过程中可能起到了重要的转录后调节作用。通过磁珠分选技术可获得较高纯度的IH来源血管内皮细胞。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R732.2

【参考文献】