髓系细胞触发受体-1在单核细胞凋亡中的作用及其机制的研究

发布时间：2018-11-08 07:19

【摘要】：第一部分脓毒症患者外周血单核细胞髓系细胞触发受体-1表达水平与凋亡的相关性研究目的：髓系细胞触发受体-1(TREM-1)分子是主要表达于外周血单核细胞和中性粒细胞表面的受体,能够放大Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)和Nod样受体(Nod-like receptors, NLRs)介导的炎症反应,在脓毒症等炎症性疾病发病机理中发挥重要作用。但是TREM-1在脓毒症单核细胞和中性粒细胞凋亡中的作用尚未明确。因此,本部分研究通过检测脓毒症患者外周血单核细胞和中性粒细胞TREM-1的表达水平和细胞凋亡率,分析细胞TREM-1的表达水平和细胞凋亡之间的相关性。研究方法：本研究纳入2012年7月1日至2012年9月4日大学附属医院外科ICU新入院脓毒症患者为研究组,排除化疗、艾滋病、激素治疗和器官移植等患者。所有纳入患者在入住重症监护病房(Intensive Care Unit, ICU)24小时内进行APACHE Ⅱ (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ)评分和SOFA(Sequential Organ Failure Assessment)评分。所有纳入患者在入住ICU24小时内均抽取全血检测全血中单核细胞和中性粒细胞的凋亡水平；同时将全血中的单核细胞和中性粒细胞分离,检测两种细胞TREM-1的表达水平。分别分析单核细胞和中性粒细胞TREM-1表达水平与其凋亡率的相关性。研究结果：本研究共纳入外科ICU中符合脓毒症诊断标准的26例患者。在原发疾病中最常见的为急性腹膜炎(26.9%)和肺炎(26.9%),其他还包括急性化脓性梗阻性胆管炎和急性重症胰腺炎等。其中16例患者细菌培养结果阳性,另外10例患者存在临床感染证据。所有患者的外周血单核细胞都检测到TREM-1表达水平和细胞凋亡率,相关性分析显示单核细胞TREM-1表达水平和单核细胞凋亡率成负相关(r=-0.49,P=0.01)。此外,26例患者中有22例成功检测到中性粒细胞TREM-1表达水平与中性粒细胞凋亡率,4例患者检测失败。中性粒细胞TREM-1表达水平与中性粒细胞凋亡率之间无显著相关性(r=-0.28,P=0.21)。研究结论：脓毒症患者外周血单核细胞TREM-1表达水平与单核细胞凋亡率呈负相关,中性粒细胞TREM-1表达水平与中性粒细胞凋亡率无显著相关性。研究结果提示：TREM-1在单核细胞抗凋亡中可能具有重要作用。第二部分TREM-1在单核细胞凋亡中的作用并初步探讨其分子机制研究目的：通过构建携带TREM-1基因的重组腺病毒表达载体,获得高表达TREM-1的单核细胞,进行TREM-1在单核细胞凋亡中的作用及其机制的研究,探讨Erk和PI3K/Akt通路和Bcl-2蛋白家族在该凋亡机制中的作用。研究方法：构建高表达TREM-1的腺病毒表达载体,感染单核细胞系THP-1细胞,用Western blot和流式细胞术检测TREM-1蛋白的表达水平。以高表达TREM-1的THP-1细胞为研究对象,采用激动性抗体激活TREM-1通路,或同时用100ng/ml脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激,随后用星形孢菌素(staurosporine, STS)诱导该细胞凋亡,采用流式细胞术检测细胞凋亡水平。采用化学抑制试验观察细胞外信号调节激酶(extracellular-signal-regulated kinase, Erk)通路和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)/Akt通路对TREM-1分子介导的细胞凋亡的影响。采用Western blot法技术检测Bcl-2蛋白家族在TREM-1分子介导的细胞凋亡中的表达水平变化。研究结果： Western-blot和流式细胞术检测证实TREM-1重组腺病毒载体构建成功,能在单核细胞系THP-1细胞中稳定表达。激活TREM-1通路能显著降低STS诱导的THP-1细胞的凋亡率(41.8%vs.63%,p0.05),且在LPS刺激诱导的THP-1细胞(体外炎症模型)中也得到了相似的结果(33.7%vs.54.3%,p0.05)。用化学药物抑制细胞外信号调节激酶(extracellular-signal-regulated kinase, Erk)或磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)/Akt通路的活化,能够减弱TREM-1对THP-1凋亡的抑制作用(Erk抑制剂：29.8%vs.77.7%, p0.05; PI3K/Akt抑制剂：29.8%vs.69.3%, p0.05)。Western blot结果显示TREM-1的激活不仅能显著地提高Bcl-2蛋白家族中抗凋亡蛋白髓样细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)的表达,而且还能逆转STS对Mcl-1蛋白的抑制作用(p0.05)。研究结论：本研究证实激活TREM-1对单核细胞具有抗凋亡作用,其机制可能与Erk和Akt信号通路的激活、以及下游抗凋亡蛋白Mcl-1的表达升高有关。第三部分明确Mcl-1分子在TREM-1介导单核细胞抗凋亡通路中的重要作用研究目的：探讨上述研究中发现的髓样细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)蛋白在单核细胞TREM-1抗凋亡通路中的确切作用,从而明确单核细胞表面TREM-1分子在细胞凋亡、免疫调控中的重要作用。研究方法：以高表达TREM-1的THP-1细胞为研究对象,采用化学抑制剂抑制TREM-1通路的下游分子Erk和Akt,Western blot方法检测Mcl-1蛋白水平的变化。采用激动性TREM-1抗体激活TREM-1受体后,加入特异性抑制Mcl-1蛋白表达的Roscovitine (20μM)与0.6μg/ml STS,流式细胞术观察Mcl-1蛋白抑制后对TREM-1发挥抗凋亡作用的影响。研究结果：抑制Erk和/或Akt信号分子均导致Mcl-1蛋白表达显著下降(p0.05)。20μM Roscovitine处理4小时后,TREM-1-THP-细胞的Mcl-1蛋白表达明显被抑制(p0.05)。将激活TERM-1通路的TREM-1-THP-1细胞用20μM Roscovitine处理后,TREM-1的抗凋亡作用被抑制(68.1%vs.39.5%,p0.05)。研究结论：本研究证实TREM-1可能是通过激活的Erk和Akt通路上调Mcl-1蛋白发挥抗凋亡作用,Mcl-1蛋白可能是TREM-1抗凋亡通路中的重要分子。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R720.597

【参考文献】