造血干细胞移植免疫重建中脱敏疗法诱导第三方免疫耐受的研究

发布时间：2019-03-06 08:50

【摘要】：遗传代谢病(inherited metabolic diseases,IMD)是一组由单一酶活性缺陷引起的遗传病,该酶是蛋白质、脂肪或碳水化合物正常代谢所必须,酶缺陷导致有害的代谢产物蓄积引起疾病。目前发现IMD超过500种,这些疾病经常导致患者存活时间受限、多系统受累及进行性进展;绝大多数IMD患者在儿童时期出现临床症状,疾病进展较慢的患者可能在成年出现症状。目前对严重IMD治疗仍十分有限,治疗原则是减少毒物蓄积、补充需要、促进排泄;治疗手段如饮食疗法、酶替代或底物降解、骨髓移植或肝移植等;但任何一种治疗方法都存在弊端。如饮食疗法可导致IMD患者营养不良;酶替代治疗不能通过血-脑屏障改善有毒代谢产物引起的脑损伤,且治疗费用昂贵;底物降解治疗经常被抗蛋白质抗体阻断,导致过敏反应、过敏性休克等;造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)不能及时改善严重遗传代谢病患者脑损伤等。严重的IMD患者通常伴有脑损伤,临床表现主要为智力、精神下降;严重神经系统疾病经常导致患者死亡。动物研究表明移植的HSC在大脑分化为小胶质细胞,通过血-脑屏障释放有功能的酶,发挥治疗脑损伤的作用。但是移植的HSC分化为小胶质细胞所需时间较长,小鼠大约需要6月,人脑大约需要6-12月;因此HSCT不能及时改善脑损伤。利用神经干细胞(neural stem cell,NSC)具有自我更新能力和分化功能,已成功用于治疗多种神经系统损伤及神经退行性疾病模型,如急性脑缺血损伤、新生鼠缺氧缺血脑损伤、阿尔茨海默病、多发性硬化症、帕金森病等。神经干细胞治疗神经系统疾病模型有一定的疗效,但细胞移植后宿主介导的排斥反应及存活率低,限制了其治疗作用的最大发挥。理论上讲,人类来源的供者细胞是最有价值的,因为只有人类来源的细胞将来可能被批准应用于临床试验治疗IMD。为了提高人来源细胞异种移植存活,通过新生期大、小鼠人类细胞脱敏,诱导成年期细胞移植耐受的研究已有报道。2009年Claire M Kelly等报道新生SD大鼠生后0-5d腹腔注射105人来源NSC(human neural stem cell,h NSC),10-12周后大脑皮层或纹状体移植(2.5-5)×105 h NSC,移植后12-40周植入率增高,移植的细胞能长期存活。2012年研究报道新生期BALB/c小鼠和Wistar大鼠腹腔注射105 h NSC,6周后大脑移植3×105 h NSC,移植后2-3周h NSC不能检测到。2014年Virginia B.Mattis等报道新生小鼠生后2-3d腹腔注射105h NSC,8周后大脑移植2×105 h NSC,移植后4周h NSC不能检测到。2013年研究报道以成年Wistar大鼠脑梗模型为基础进行h NSC脱敏或免疫抑制剂治疗,h NSCT后2周移植的h NSC几乎不能检测到;提示在局部脑损伤Wistar大鼠,不同途径免疫抑制不能延长移植的人脐血来源NSC存活。2016年Andreas heuer等研究报道新生期SD大鼠生后2d和4d进行腹腔注射分化前的人来源胚胎干细胞进行脱敏,成年后(最小15周龄)建立多巴胺能纤维束损伤模型,建模后4-5周进行人胚胎干细胞来源的神经前体细胞大脑移植,移植后18-22周89%大鼠可检测到人类细胞,提示新生期人来源细胞脱敏可以实现成年后人来源细胞移植长期存活。以上研究提示新生鼠除SD大鼠外,其它如BALB/c、C57BL/6、NOD SCID、B6C3F1/J、FVB(P1-4)小鼠及Wistar大鼠,新生期腹腔注射人来源细胞进行脱敏,成年后大脑移植均不能耐受。SD大鼠细胞脱敏可以实现免疫耐受,可能与该物种是远交系相关;也可能新生期SD大鼠较同期其它类型鼠免疫更不健全。建立清髓异基因造血干细胞(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)模型摧毁免疫系统,模拟新生期鼠免疫不健全;探讨allo-HSCT免疫不健全时期进行第三方人来源细胞脱敏,免疫健全后进行细胞移植能否实现耐受。文献报道HSCT模型多选用小鼠进行研究,受体BALB/c小鼠和供体C57BL/6小鼠可以成功建立allo-HSCT模型,可以模拟临床allo-HSCT免疫不健全时期。因此本研究选用BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠建立allo-HSCT模型。本研究可为IMD患者allo-HSCT不能及时改善脑损伤提供可参考的途径,国内外尚无报道。目的基于新生期h NSC脱敏研究,致死性全身放射摧毁小鼠免疫及造血功能,通过小鼠allo-HSCT解救,在免疫重建过程中应用h NSC多次脱敏,实现免疫重建后对h NSC的免疫耐受。方法9-12周雌性BALB/c小鼠为受体鼠,9-12周雌性C57BL/6小鼠为供者鼠。分离供者鼠骨髓细胞,去T细胞进行尾静脉骨髓移植,建立稳定嵌合清髓小鼠allo-HSCT模型。模型建立成功后,90只模型小鼠随机分为三组:A组(NSCT组)、B组(脱敏组)、C组(环孢素组)。B组在HSCT后第1、3、7d进行h NSC腹腔注射脱敏,A、C组在相同时间点进行腹腔注射50ul生理盐水。HSCT稳定嵌合及供者T细胞植入后行小鼠大脑h NSCT,C组移植前1d至脱臼处死当日,每日行腹腔注射10mg/kg环孢素,A、B组每日行腹腔注射10mg/kg环孢素相同体积的生理盐水。HNSCT后2、8、12W,三组均行h NSC体外杀伤试验、体内存活率及分化、排斥反应、炎性反应检测。结果1.受体BALB/C小鼠经致死性放射清髓后,供体C57BL/6小鼠骨髓去T细胞HSCT;HSCT后2周,受体鼠存活率为100%,小鼠精神可,活动有力;HSCT后4周,受体鼠存活率约80%,无脱毛症状。2.清髓小鼠allo-HSCT后4、8周,供体鼠细胞嵌合率均为76%±1%,供体鼠T细胞占植入细胞的37%±1%。3.人来源NSCT后12周,进行受体BALB/C小鼠脾脏T细胞体外杀伤h NSC实验检测。A、B、C组体外杀伤率分别为28.26%±2.80%、23.94%+2.11%、23.62%±0.15%,P=0.36。三组间差异无统计学意义。4.人来源NSCT后2、8、12周,A、B、C组移植的h NSC存活率进行比较,差异均无统计学意义。NSCT后2周,A、B、C组移植的h NSC存活率分别为0.42%±0.02%、0.45%±0.05%、0.53%±0.01%,P=0.08;HNSCT后8周,A、B、C组移植的h NSC存活率分别为0.21%±0.01%、0.18%±0.02%、0.24%±0.02%,P=0.20;HNSCT后12周,A、B、C组移植的h NSC存活率分别为0.16%±0.01%、0.16%±0.01%、0.20%±0.01%,P=0.26。5.人来源NSCT后2、8、12周,小鼠大脑冰冻切片免疫荧光染色提示:h NSCT后2、8、12周,三组排斥反应及炎性反应指标MHC-Ⅱ、CD3、Iba-1、CD68均为阳性。移植的h NSC分化情况:移植后2周,三组GFAP(星形胶质细胞)、β-tubulin(神经元)免疫荧光染色均为阴性;移植后8、12周,GFAP免疫荧光染色三组均为阳性,β-tubulin免疫荧光染色三组均为阴性。结论1.骨髓去T细胞移植可以成功建立清髓异基因小鼠HSCT模型。2.清髓小鼠allo-HSCT免疫重建中,尽管h NSC脱敏疗法不能实现h NSC免疫耐受,但是可以少数长期存活。3.少数存活的h NSC可以长期存活,并且短期可能分化为能分泌多种酶的星形胶质细胞,相对供者HSC于大脑分化为能分泌正常酶的白细胞及时,为临床治疗IMD脑损伤提供了可参考的途径。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R725.9

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