靶向5’UTR的化学修饰siRNAs抑制肠道病毒71型感染的研究

发布时间：2019-03-14 12:31

【摘要】：背景与目的：肠道病毒71型（EV71）是引起手足口病的主要病原体，多感染学龄前儿童，尤以3岁以下发病率最高。近年来，EV71的暴发和流行在亚太地区呈明显上升趋势，且引起严重的中枢神经系统症状。在世界大多数国家和地区基本消灭脊髓灰质炎病毒之后，EV71被认为是临床最重要的嗜神经性病毒，严重危害儿童的身体健康。目前临床治疗EV71感染主要是减轻症状，寻求安全、特异、有效的药物治疗手段已经成为世界范围关注的热点。 RNA干扰（RNAi）是双链RNA介导的序列特异性的转录后基因沉默。由于RNAi具有特异性、高效性等特点，它已被成功应用于抗病毒感染研究。分子流行病学分析表明，EV71中国流行株在近10余年内没有发生很大的基因多态性改变，所以寻求RNAi的有效靶点、通过效应分子小干扰RNA（siRNA）抑制多株EV71中国流行株成为可能。既往研究表明，靶向EV71基因组3’UTR、VP1、3D、2C、3C区域的siRNAs能够有效抑制EV71感染，而针对EV71基因组高度保守的5’非编码区（UTR）的特异、有效siRNAs尚未见到报道。EV71基因组5’UTR高度保守，其在病毒RNA的合成以及病毒蛋白的翻译过程中发挥重要作用，以此为靶点筛选有效siRNAs将可能具有广谱抗EV71效能。近年来，siRNAs的化学修饰研究取得了很大的进步，对筛选的有效siRNAs进行合适的化学修饰可以优化siRNA的特性，极大推动siRNA进入临床的可能性。本研究旨在筛选靶向EV71基因组高度保守的5’UTR的有效siRNAs，确定有效靶点序列，并通过化学修饰优化siRNAs的特性，检测它们针对EV71中国流行株是否具有广谱抗病毒效能，并研究靶向5’UTR的化学修饰siRNAs对乳鼠EV71感染的抑制作用，为RNAi治疗EV71走向临床提供一定的实验基础。方法： 1.采用多特征融合的方法，设计靶向EV71基因组5’UTR的siRNAs。 2.通过细胞毒性实验检测siRNAs对RD细胞生存和生长的影响。 3.通过细胞生存实验、实时TaqMan RT-PCR实验筛选有效的siRNAs，确定有效靶点序列。 4.针对筛选出的两个有效siRNAs的双链RNA的UC序列分别进行2’-OMe修饰及2’-F修饰，得到6个未修饰及化学修饰siRNAs（si-1、si-1OMe、si-1F、si-2、si-2OMe、si-2F）。 5.通过激光共聚焦及流式细胞仪技术检测siRNA转染情况。 6.从细胞毒性、RNAi活性、免疫刺激反应、血清稳定性四个方面，对靶向5’UTR的未修饰siRNAs与相应的化学修饰siRNAs进行比较。 7.将Genbank中近5年来发布的具有全基因序列的108株EV71中国流行株进行比对，分析siRNAs对应序列的同源性。 8.针对核苷酸序列分析结果，采用另一株中国流行株EU703812进行实验（此病毒株基因组特点是在115-133核苷酸序列与si-1对应序列完全匹配，而在648-666核苷酸序列与si-2对应序列有一个核苷酸错配，此相同且单一核苷酸错配在近5年来发布的具有全基因序列的108株中国流行株中达41.66%），，比较siRNAs对两株不同EV71中国流行株感染的抑制作用。 9.将si-2改变一个核苷酸使之完全与病毒株EU703812对应，并进行修饰，评估未修饰及化学修饰siRNAs对病毒株EU703812的抑制作用。 10.通过EV71感染乳鼠的实验研究，建立EV71感染乳鼠模型。 11.通过乳鼠症状、体重、生存率等指标评价化学修饰siRNAs对乳鼠的毒性。 12.通过观察感染乳鼠的症状、体重、生存率，实时荧光定量RT-PCR检测感染乳鼠小肠组织中EV71RNA转录水平，组织切片HE染色观察感染乳鼠小肠组织病变及免疫组化检测感染乳鼠肠上皮细胞中EV71特异性VP1蛋白表达，初步探讨靶向5’UTR的化学修饰siRNAs对乳鼠EV71感染的抑制作用。结果： 1.筛选出靶向EV71基因组高度保守的5’UTR的有效siRNAs （1）初步筛选出满足设计条件的靶向EV71基因组5’UTR的si-1、si-2、si-3、si-4、si-55个siRNAs。（2）所筛选出的siRNAs均未影响RD细胞生存及生长，对培养细胞无明显毒性。（3）靶向EV71基因组5’UTR的si-1、si-2能够明显提高感染细胞的生存率、降低感染细胞中EV71RNA的转录水平，且这种抗病毒效能具有序列特异性。 2.靶向5’UTR的未修饰及化学修饰siRNAs对EV71感染的体外抑制作用（1）SiRNA转染6h后，激光共聚焦显微镜检测发现带有荧光素标记的si-2FAM在RD细胞浆中清晰可见，随着si-2FAM浓度的升高，RD细胞中si-2FAM含量明显增加；进一步用流式细胞仪精确检测转染效率，在25nM、50nM、100nM的浓度下，si-2FAM的转染效率分别为79.47±1.79%、87.73±2.67%、97.17±0.86%。因此，50nM、100nM已足够进行下一步RNAi实验。（2）无论是未修饰的还是化学修饰的21nt siRNAs均未影响RD细胞生存及生长，对培养细胞无明显毒性。（3）与相应的未修饰siRNAs相比，化学修饰的si-1F、si-2OMe、si-2F显现出相似的的RNAi的活性，能够延缓及减轻EV71感染致CPE、明显提高EV71感染细胞的生存率、明显降低感染细胞中EV71RNA的转录水平、明显降低感染细胞中EV71特异性VP1蛋白的表达、明显降低EV71病毒滴度；靶向EV71基因组5’UTR648-666核苷酸序列的化学修饰的si-2OMe、si-2F抗病毒效能优于靶向EV71基因组5’UTR115-133核苷酸序列的si-1F；化学修饰的si-1OMe抗病毒效能明显降低。（4）转染未修饰及化学修饰siRNAs的细胞中均未出现PKR的升高，siRNAs作用的机制是由于特异性RNAi而非PKR的活化及干扰素反应。（5）未修饰的si-2在10%FBS、100%鼠血清及100%人血清中孵育6h后均不能检测出，而化学修饰的si-2OMe、si-2F在同样的条件下至少能检测到48h。 3. SiRNAs对EV71中国流行株感染的抑制效能（1）通过核苷酸序列分析表明，靶向EV71基因组5’UTR115-133核苷酸序列的siRNAs对应序列的同源性达71.30%，靶向EV71基因组5’UTR648-666核苷酸序列的siRNAs对应序列的完全同源性达37.04%，相同且单一核苷酸不同的达41.66%。（2）SiRNAs对两株EV71中国流行株感染的抑制作用比较表明：si-1、si-2均可提高感染两株病毒的RD细胞生存率、降低细胞中EV71RNA的转录水平；si-1对两株病毒株同样有效，si-2对EU703812病毒株的效能低于HM003207病毒株，但仍能明显提高感染EU703812病毒株的RD细胞生存率、降低细胞中EV71RNA的转录水平。（3）改变一个核苷酸的siRNAs对病毒株EU703812的抑制作用研究表明，未修饰及化学修饰siRNAs均可以显著提高感染EU703812病毒株的RD细胞生存率、降低细胞中EV71RNA的转录水平、减少细胞中EV71特异性VP1蛋白的表达。 4.靶向5'UTR的化学修饰siRNAs对乳鼠EV71感染的抑制作用（1）建立了EV71感染1日龄ICR乳鼠模型。感染EV71的乳鼠可出现精神不振、活动减少等症状，在感染6～7天后上述症状消失。死亡时间多发生在病毒感染后24～96h，死亡率为30.0%。感染乳鼠体重增长相对缓慢，6～7天时与正常乳鼠差异最大，之后存活的感染乳鼠与正常乳鼠体重差距缩小。EV71感染第3天、5天，乳鼠小肠、肺、骨骼肌均可检测出病毒RNA，7天骨骼肌不能检测出病毒RNA，小肠、肺组织中含量也比较低，第14天各种组织均不能检测出病毒RNA。感染第5天乳鼠小肠组织病变明显，肠上皮细胞出现空泡变性。（2）化学修饰siRNAs对乳鼠毒性研究表明，直至14天，转染si-2A-OMe或si-2A-F的乳鼠精神、活动均无明显变化，未出现死亡，体重增长未发生变化。（3）通过RNAi乳鼠体内实验研究表明，靶向5’UTR的化学修饰siRNAs改善了乳鼠的感染症状，提高了EV71感染乳鼠的生存率，明显降低了感染乳鼠小肠组织中EV71RNA的转录水平，减轻了小肠组织病变，降低了肠上皮细胞中EV71特异性VP1蛋白表达。结论：本研究筛选出靶向EV71基因组高度保守的5’UTR的两个有效siRNAs，确定了EV71基因组5’UTR115-133核苷酸序列与648-666核苷酸序列两个新的有效靶点。首次研究化学修饰siRNAs对EV71感染的抑制作用，获得生物利用度高、稳定性强的有效化学修饰siRNAs。通过核苷酸序列分析及不同的EV71中国流行株验证，发现靶向EV71基因组5’UTR115-133核苷酸序列与648-666核苷酸序列的有效siRNAs可能对多株EV71中国流行株具有广谱抗病毒效能。针对EV71基因组5’UTR648-666靶点的siRNAs具有更高的抗病毒效能。可针对EV71基因组5’UTR115-133、648-666靶点序列设计siRNAs混合物（包括考虑单一核苷酸的错配在同一位点设计一对siRNAs），对多株EV71中国流行株可能具有更广谱的抗病毒效能。此外，通过乳鼠体内试验进一步证实化学修饰的si-2A-OMe、si-2A-F对乳鼠无明显毒性作用，并且能够有效抑制乳鼠EV71感染。本研究为EV71的基因治疗药物的研究奠定了基础，为siRNA抗EV71感染最终走向临床提供了实验基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R725.1

【参考文献】