【摘要】：支气管哮喘(broncahial asthma)简称哮喘,是一种常见的呼吸道疾病,其特征为气道炎症细胞的存在和气道结构的改变即“气道重塑”,可导致不可逆的气道阻塞、气道高反应、肺功能下降等。其中,气道重塑是由于持续性的炎症反应和上皮细胞的损伤而导致的,现在已经非常清楚气道重塑可导致难以治疗的严重哮喘。很多研究表明,支气管平滑肌细胞(ASMC)在气道重塑中发挥着关键作用,不仅通过它们的收缩功能,更重要的是,通过很多介质作用于哮喘状态,但其机制尚未确定。目前哮喘的治疗主要以控制症状为主,故探讨哮喘气道重塑的发生机制对哮喘的预防与治疗具有重大意义。很多研究表明,凝血酶在气道重塑的过程中起重要的作用。我们通过建立哮喘大鼠模型探讨凝血酶活性与哮喘气道重塑的相关性。我们此研究分为二部分：①凝血酶通过PAR-1激活ERK1/2信号调控哮喘大鼠气道重塑；；②哮喘大鼠凝血酶、气道炎症、气道重塑的相关性研究第一部分凝血酶通过PAR-1激活ERK1/2信号调控哮喘大鼠气道重塑研究目的气道重塑是气流阻塞的原因,是哮喘病理生理变化的核心,其特点是气道平滑肌肥厚和其他一些变化,包括基底膜增厚、上皮细胞缺失、炎性细胞浸润,杯状细胞增生。导致这些变化的确切的介质及其调节机制目前仍不明确。而气道重塑对哮喘有非常重要的影响：气道高反应性、不可逆的气流受限、哮喘急性发作甚至导致患者死亡。因此,更深入的研究气道重塑的机制是非常重要而且必须的。凝血酶是在血液凝固级联反应中形成的,除了其蛋白水解作用,凝血酶可以通过激活蛋白酶激活受体启动许多细胞。而近年来研究表明,凝血酶除了在凝血机制中的中心作用,在气道炎症和气道重塑中亦有重要作用,但具体机制尚不明了。支气管平滑肌细胞(ASMC)在气道重塑中具有重要作用。支气管平滑肌的变化程度与哮喘的严重程度相关。已证实ASMC是丰富的促炎症因子的来源,如细胞因子、趋化因子,并且作用于气道重塑中的细胞增殖、迁移和炎症细胞相互作用。细胞外信号调节激酶(ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的一条重要的信号传导途径,ERK1和ERK2是其中研究最完善的,它们通过磷酸化激活,进而调控细胞的增殖、分化、凋亡等。pERK1/2为其磷酸化水平,可调控气道平滑肌细胞的异常增殖和分泌细胞因子,参与气道重塑。蛋白酶活化受体-1(PAR-1)是一个G-耦合的、可以被丝氨酸蛋白酶(如凝血酶)激活的膜蛋白。其原名凝血酶受体,当凝血酶切割其氨基酸端的特定位置时被激活。PARs分布广泛,其中PAR-1可表达在所有类型的细胞中。在呼吸系统中,PAR-1表达在上皮细胞和平滑肌细胞。因此,我们提出了一个假设,即凝血酶通过PAR-1激活ERK1/2信号通路,进而参与哮喘大鼠气道重塑。研究方法将36只雌性大鼠随机分为6组,正常对照组(SAL组)、哮喘模型组(OVA+SAL组)、凝血酶组(OVA+thrombin组)、水蛭素组(OVA+hirudin组)、凝血酶+PERK1/2抑制剂PD98059组(OVA+thrombin+pERK1/2-inh组)、凝血酶+PAR-1抑制剂ER-112780-06组(OVA+thrombin+PAR-1-inh组),每组6只。以卵蛋白(OVA)致敏并吸入激发制备大鼠哮喘模型。模型组于第1、8天注射卵蛋(lml/kg),第15天始雾化2%卵蛋白(现配)每次30分钟,每周3次,共6周,SAL组以生理盐水代替。第15天起雾化前,OVA+thrombin组进行凝血酶雾化吸入72u/只,OVA+hirudin组进行hirudin气溶胶2000AUT吸入,OVA+thrombin+pERKl/2-inh组雾化凝血酶雾化吸入72u／只后每只腹腔注射PD98059(3mg/kg), OVA+thrombin+PAR-1-inh组进行凝血酶雾化吸入72u／只及浓度为20uM的ER-112780-06雾化吸入30分钟,其他各组以生理盐水代替。造模结束后,取大鼠肺组织,用免疫组化、western blot及PCR检测PAR-1的表达,用western blot检测pERK1/2的表达。结果1.一般表现实验前各组大鼠行为能力正常,在造模过程中,模型组均出现不同程度的异常表现。SAL组：在激发时无烦躁不安,呼吸平稳,行动灵敏,生活习性正常,毛色有光泽。OVA+SAL组：在激发时均出现不同程度的烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁等症状,严重者呼吸减慢或节律不齐,行动迟缓或俯伏不动。经过多次激发后,OVA+SAL组上述症状反而有所减轻,毛色无光泽。OVA+thrombin组：在激发时烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁等症状非常明显,比OVA+SAL组严重；后期则多俯伏不动,毛色暗黄色,有一只死亡。OVA+hirudin组：在激发时有轻度烦躁不安、呼吸略增快,无呼吸减慢或节律不齐,与OVA+thrombin组相比较症状明显减轻。OVA+thrombin+pERK1/2-inh组：在激发时出现烦躁不安现象较轻,呼吸增快,偶尔出现大小便失禁状况,无呼吸减慢或节律不齐,无行动迟缓或俯伏不动现象,毛色正常。OVA+thrombin+PAR-1-inh组：在激发时轻度烦躁不安、呼吸增快,无呼吸减慢或节律不齐,无行动迟缓或俯伏不动现象,毛色正常。2.气道重塑OVA+SAL组与SAL组比较,平滑肌增厚。OVA+thrombin组与OVA+SAL组比较,平滑肌增厚更明显。OVA+hirudin组与OVA+thrombin组相比较,平滑肌无明显增厚。OVA+thrombin+pERK1/2-inh组、OVA+thrombin+PAR-1-inh组分别与OVA+thrombin组相比平滑肌增厚不明显。3. Western blot检测各组肺组织pERK1/2表达结果SAL组：正常对照组大鼠肺组织仅有极少量pERK1/2的表达。OVA+SAL组：pERK1/2表达水平很高,即ERK1/2的磷酸化水平很高,与正常对照组比较有统计学意义(P0.05)。OVA+thrombin组：ERK1/2的磷酸化水平极高,与哮喘组比较有统计学意义(图3,P0.05)。OVA+thrombin+pERK1/2-inh组：pERKl/2表达水平低,与T组比较有统计学意义(P0.05)。4.PAR-1蛋白表达PAR-1阳性细胞SAL组表达水平很低,OVA+SAL组表达水平很高,与SAL组相比有统计学意义(P0.05), OVA+thrombin组表达水平最高,与OVA+SAL组比较有统计学意义(P0.05), OVA+hirudin组的表达则下降,与OVA+thrombin组比较有统计学意义(P0.05), OVA+thrombin+PAR-1-inh组的表达水平明显降低,与OVA+thrombin组相比有统计学意义(P0.05)。结论1.凝血酶可以上调大鼠呼吸道PAR-1的基因与蛋白表达；2.凝血酶可通过PAR-1激活ERK1/2信号通路；3.凝血酶激活pERKl/2信号通路,从而参与哮喘大鼠气道重塑。第二部分 哮喘大鼠凝血酶、气道炎症、气道重塑的相关性研究研究目的气道炎症是急、慢性肺的发病机理,哮喘即包括在内。伤害性的刺激物可以激活各种细胞,包括嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞,释放血管活性物质、有毒代谢物和细胞因子,从而参与急性和慢性支气管收缩。IL-6即是参与其中的一个细胞因子,亦是一种炎症存在的生化指标。研究证实,凝血酶通过介导NF-κB的激活参与了气道雁阵反应。claudin-1作为一种缝隙连接蛋白,多表达于上皮细胞膜,保护肺组织免受病原体的侵害。研究表明,哮喘患者肺组织中紧密连接带变薄或被破坏。而反复的炎症刺激可引起组织损伤及后续的组织结构改变即气道重塑。本实验外源性给予凝血酶及凝血酶抑制剂,建立标准大鼠哮喘动物模型。通过ELISA法、HE染色、免疫荧光检测、免疫组化、western blot等试验方法,探讨凝血酶对哮喘大鼠气道炎症的影响,从而为凝血酶促进哮喘气道重塑机制的探讨提供新的思路。研究方法将24只雌性大鼠随机分为4组：正常对照组(SAL组)、哮喘组(OVA+SAL组)、凝血酶组(OVA+thrombin组)、凝血酶抑制剂组(OVA+hirudin组),每组6只。参照文献方法制备大鼠哮喘模型。第15天开始用402超声雾化器予大鼠雾化吸入2%OVA悬液50m1(现配),每次30分钟,每周3次,连续激发6周。雾化前30分钟,OVA+thrombin组每只大鼠给予雾化吸入凝血酶72u,OVA+hirudin组每只大鼠给予雾化吸入水蛭素(500u/kg)。SAL组用生理盐雾化。造模成功后,取大鼠肺泡灌洗液,采用ELISA法测其中的凝血酶活性。取肺组织,应用HE染色观察炎性细胞的浸润情况,免疫荧光检测各组大鼠气道claudin-1的表达情况,免疫组化法检测IL-6表达水平,western blot法测定NF-kB蛋白表达情况。结果1.肺组织炎症浸润情况观察OVA+SAL组：支气管壁、间隔及血管周围有大量的炎性细胞浸润,与SAL组相比有统计学意义(P0.05)。OVA+thrombin组炎症浸润情况较OVA+SAL组更为明显(P0.05)。OVA+hirudin组炎性细胞浸润减轻较()VA+thrombin组减轻(P0.05)。2.免疫荧光检测claudin-1的表达OVA+SAL组气道上皮细胞胞膜claudin-1表达减少,上皮完整性稍有破坏与SAL组比较有差异。OVA+thrombin组气道上皮细胞胞膜claudin-1表达微弱,上皮完整性破坏严重,与OVA+SAL组比较有差异。OVA+hirudin组claudin-1阳性表达细胞较OVA+thrombin组增多。3.免疫组织化学法肺组织中IL-6的表达结果OVA+SAL组较SAL组IL-6表达增多(P0.05)。OVA+thrombin组IL-6阳性表达较OVA+SAL组明显(P0.05)。OVA+hirudin组较OVA+thrombin组IL-6表达减少(P0.05)。4. Western Blot法检测肺组织中NF-kB蛋白表达的结果OVA+SAL组较SAL组肺组织中NF-kB蛋白表达增加(P0.05)。OVA+thrombin组较OVA+SAL组肺组织中NF-kB蛋白表达增高(P0.05)。OVA+hirudin组较OVA+thrombin组肺组织中NF-kB蛋白表达减少(P0.05)。结论1.凝血酶促进哮喘大鼠气道炎症反应；2.凝血酶可导致哮喘大鼠气道上皮claudin-1表达减少。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R725.6
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 徐卫华,沈华浩;肺泡巨噬细胞合成转化生长因子β1在慢性阻塞性肺疾病气道重塑中的作用[J];中华结核和呼吸杂志;2005年01期
2 陈玉娟;;气道重塑的治疗研究进展[J];新医学;2008年03期
3 李丽丽;黄茂;;气道重塑评估技术的研究进展[J];中华哮喘杂志(电子版);2009年02期
4 管频;李伟;;慢性阻塞性肺疾病气道炎症与气道重塑研究进展[J];海南医学;2010年17期
5 李红;张沙沙;;气道重塑与慢性阻塞性肺疾病[J];中国现代药物应用;2011年20期
6 秦明明;朱薇薇;李峰;;凝血酶与气道重塑的研究进展[J];中国儿童保健杂志;2012年06期
7 张莉莉;尚莉丽;;神经信号转导通路与气道重塑[J];临床肺科杂志;2012年11期
8 刘磊;刘彬;朱莉莉;张薇;;参芎葡萄糖注射液对特发性肺间质纤维化患者气道重塑的影响[J];中国老年学杂志;2011年22期
9 宋一平;生长因子在气道重塑中的作用[J];国外医学.呼吸系统分册;1999年01期
10 宋一平;崔德健;茅培英;梁延杰;彭瑞云;崔雪梅;王德文;;慢性阻塞性肺疾病大鼠模型气道重塑病理组织学表现和细胞外基质变化的研究[J];感染.炎症.修复;2000年01期
相关会议论文 前10条
1 周亮;鲁继荣;马青山;成焕吉;汤钟玲;林亚琳;;药物对支气管哮喘气道重塑模型干预效果的研究[A];中华医学会第五次全国哮喘学术会议暨中国哮喘联盟第一次大会论文汇编[C];2006年
2 许霞;韩秀迪;王洪超;肖伟;;慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺组织中尿激酶型纤溶酶原激活物系统成分与气道重塑关系的研究[A];中华医学会第七次全国呼吸病学术会议暨学习班论文汇编[C];2006年
3 戴文鑫;罗百灵;王丽静;;胰岛素样生长因子Ⅰ在慢性阻塞性肺疾病大鼠小气道重塑中的作用研究[A];中华医学会第七次全国呼吸病学术会议暨学习班论文汇编[C];2006年
4 李晓辉;栾斌;;表皮生长因子受体与支气管哮喘气道重塑[A];中华医学会第十五次全国儿科学术大会论文汇编（上册）[C];2010年
5 朱艳芬;宋泽庆;;哮喘小鼠气道重塑中α平滑肌肌动蛋白的表达[A];中华医学会呼吸病学年会——2011（第十二次全国呼吸病学学术会议）论文汇编[C];2011年
6 李艳萍;;小鼠气道重塑模型早期核因子κB通路中转化生长因子β_1表达的研究[A];中华医学会第七次全国呼吸病学术会议暨学习班论文汇编[C];2006年
7 王光辉;金发光;楚东岭;段丽;;支气管哮喘豚鼠气道重塑中的基质金属蛋白酶9及其抑制物的表达[A];中华医学会第五次全国哮喘学术会议暨中国哮喘联盟第一次大会论文汇编[C];2006年
8 林洁;戴元荣;颜孙舜;吴斌;;成肌纤维细胞在气道重塑中的作用及地塞米松对其影响[A];华东地区第6届中青年呼吸医师论坛暨浙江省第29届呼吸疾病学术年会论文汇编[C];2007年
9 王传夏;李昌崇;罗运春;李孟荣;叶乐平;;肺泡巨噬细胞在哮喘大鼠气道重塑中的作用[A];2005年浙江省儿科学学术年会论文汇编[C];2005年
10 王苹莉;张根生;覃雪军;邱章伟;李娜;李雯;沈华浩;;早期多次卡介苗接种对哮喘小鼠气道重塑的影响[A];中华医学会第七届全国哮喘学术会议暨中国哮喘联盟第三次大会论文汇编[C];2010年
相关重要报纸文章 前1条
1 傅俊英;中药可干预COPD患者气道重塑[N];中国医药报;2008年
相关博士学位论文 前10条
1 王桂成;IL-20在支气管哮喘Th2免疫应答及气道重塑中作用的研究[D];山东大学;2015年
2 沈启英;七氟醚对哮喘小鼠气道炎症和气道重塑的影响及机制探讨[D];安徽医科大学;2015年
3 蒋婧瑾;TLR3参与COPD气道重塑的发生及机制研究[D];浙江大学;2015年
4 毕玫荣;哮喘大鼠凝血酶活性与气道重塑的相关性研究[D];山东大学;2016年
5 王苹莉;早期多次卡介苗接种对哮喘小鼠气道重塑的影响及相关免疫机制研究[D];浙江大学;2010年
6 周亮;关于儿童哮喘相关基因与气道重塑的研究[D];吉林大学;2006年
7 辛晓峰;支气管哮喘气道重塑的临床与实验研究[D];第二军医大学;2006年
8 李艳萍;小鼠气道重塑模型中NF-κB通路与角质细胞生长因子和转化生长因子相关作用研究[D];四川大学;2007年
9 董亮;转录因子T-bet/GATA-3调节哮喘气道炎症及气道重塑的机制研究[D];山东大学;2007年
10 林晓冰;加味射麻止喘方对哮喘大鼠气道重塑及信号转导通路的研究[D];广州中医药大学;2012年
相关硕士学位论文 前10条
1 杜彩霞;核心蛋白聚糖对哮喘小鼠气道重塑的影响[D];青岛大学;2013年
2 徐增梅;哮病中医证候分布特点及麻芍平喘汤对哮喘大鼠模型气道重塑的干预研究[D];安徽中医药大学;2015年
3 刘静;平喘宁调节ERK信号通路相关蛋白干预哮喘气道重塑的效应机制研究[D];安徽中医药大学;2015年
4 李丽;白三烯受体拮抗剂干预哮喘小鼠气道重塑中Th17细胞/CD4~+CD25~+Treg细胞的动态变化及相关机制[D];四川医科大学;2015年
5 孟祥珍;联合应用IL-4MT及sIL-5Rα对哮喘小鼠气道重塑及TGF-β1、Act-A的影响[D];第四军医大学;2015年
6 巩雪芳;支气管哮喘气道重塑中地塞米松对碱性成纤维细胞生长因子、神经生长因子表达的影响[D];山西医科大学;2010年
7 王尧;氧化应激与哮喘气道炎症、气道重塑的关系及药物干预的实验研究[D];南昌大学;2009年
8 缑剑;低剂量茶碱对丙烯醛诱导的大鼠气道重塑的干预作用[D];泸州医学院;2010年
9 罗俊明;丹参对哮喘大鼠气道重塑影响的实验研究[D];南昌大学;2010年
10 李锋;基质金属蛋白酶-9/组织金属蛋白酶抑制剂-1在小鼠哮喘模型气道重塑中的动态表达[D];安徽医科大学;2005年
，
本文编号：
2449220
