PID1脂肪组织特异性转基因小鼠的构建及表型分析

发布时间：2019-04-17 09:15

【摘要】：肥胖正成为全球关注的严重公共卫生问题。随我国经济快速发展和人民生活方式改变，肥胖在我国也逐渐呈现流行趋势。近年来，肥胖儿童检出率不断增高、2型糖尿病呈现明显低龄化趋势的现象已引起各国儿科学者的广泛关注。我国有关肥胖儿童、青少年的研究发现，肥胖儿童中目前诊断为2型糖尿病的人数尽管不多，但却普遍存在胰岛素抵抗指数的升高与葡萄糖耐量实验的异常，而胰岛素敏感性降低或胰岛素抵抗是2型糖尿病发生的早期重要事件，因此探讨肥胖及肥胖所致胰岛素抵抗的发病机制也已成为儿科研究领域的一个重要研究内容。 PID1基因（也称NYGGF4基因），是本研究小组克隆到的一条人类全长新基因（GenBank登录号AY317148）。前期研究发现，该基因差异高表达于肥胖者网膜脂肪组织中，且在骨骼肌、脂肪、心肌等胰岛素作用的靶组织中呈现较高表达；细胞水平研究证实，该基因的表达随前体脂肪细胞的分化进程逐渐升高，在成熟脂肪细胞中表达最高，其表达受多种胰岛素敏感性相关因子（如肿瘤坏死因子alpha、白细胞介素6等）的调控，提示该基因可能在成熟脂肪细胞中发挥重要作用，且可能与脂肪细胞胰岛素敏感性的调节相关。进一步研究显示，PID1能够通过胰岛素信号转导途径中IRS1-PI3K-AKT信号通路调节脂肪细胞胰岛素的敏感性。前期研究均局限于体外水平，为了进一步研究PID1基因对肥胖及胰岛素敏感性的作用，本文首次构建了PID1脂肪组织特异性转基因小鼠模型，在体进一步探讨该基因对小鼠肥胖表型发生、糖脂代谢及胰岛素敏感性的影响，并探讨其作用机制。第一部分PID1脂肪组织特异表达转基因小鼠的构建目的：构建PID1脂肪组织特异性表达载体pL253-aP2-PID1，建立PID1脂肪组织特异性转基因小鼠。方法： RT-PCR法克隆小鼠PID1基因CDS，把PID1基因插入脂肪组织特异表达的脂肪蛋白2（ap2）启动子的下游，构建转基因表达载体pL253-aP2-PID1。用限制性内切酶Pvu1将pL253-aP2-PID1线性化，通过显微注射法将线性化的转基因表达载体注射到小鼠受精卵原核。PCR检测转基因首建鼠（founder）的基因型，Western Blot检测鼠源性PID1基因在转基因小鼠脂肪组织中的表达。结果：1）成功构建了脂肪组织特异性表达载体pL253-aP2-PID1；2）建立了2个株的脂肪组织特异表达PID1转基因小鼠。结论：PID1脂肪组织特异性转基因小鼠构建成功。第二部分PID1脂肪组织特异性转基因小鼠正常饮食下的表型分析目的：观察PID1脂肪组织特异性转基因小鼠在正常饮食下的肥胖表型发生、糖脂代谢变化及胰岛素敏感性。方法：PID1脂肪组织特异性转基因（transgenic mice，TG）小鼠和同年龄、同性别野生型（wild type，WT）小鼠，从出生后21天（断奶）开始，每两周称量体重；HE染色观察脂肪、肝脏组织形态学改变；代谢笼实验实时监测小鼠摄食、产热、耗氧量、CO2产生、呼吸商、活动等能量代谢和活动能力的变化；采用血液生化指标（血糖、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白），评价小鼠的糖脂代谢变化；通过血清胰岛素水平、葡萄糖耐量实验、胰岛素耐量实验，评价小鼠胰岛素敏感性的变化。结果：1）PID1脂肪组织特异性TG小鼠的体重与对照比较无显著性差异；HE染色结果发现脂肪细胞的大小也无明显变化；2）PID1脂肪组织特异性TG小鼠的肝脏脂滴与对照比较无明显差异；3）PID1脂肪组织特异性TG小鼠与对照比较，摄食、耗氧量、产热以及CO2产生、呼吸商均无显著差异；但转基因小鼠的活动能力明显增加；4）PID1脂肪组织特异性TG小鼠与对照比较，血糖、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白均无显著差异；5）PID1脂肪组织特异性TG小鼠与对照比较，血清胰岛素水平、葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验结果均无明显差异。结论：PID1脂肪组织特异性TG小鼠与WT小鼠在正常饮食下肥胖表型指标、糖脂代谢以及胰岛素敏感性均无显著性变化。第三部分PID1脂肪组织特异性转基因小鼠高脂饮食诱导下的表型分析目的：观察PID1脂肪组织特异性转基因小鼠在高脂饮食诱导下的肥胖表型发生、糖脂代谢变化及胰岛素敏感性，并初步探讨这些变化的可能机制。方法：正常饮食喂养的PID1脂肪组织特异性TG小鼠及同年龄、同性别WT小鼠，出生后2个月（性成熟）后改用高脂饲料喂养，且每周称量小鼠的体重；采用HE染色观察脂肪、肝脏组织形态学改变；采用血液生化指标（血糖、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、甘油三酯清除率），评价PID1脂肪组织转基因小鼠的糖脂代谢变化；通过血清胰岛素水平、葡萄糖耐量实验、胰岛素耐量实验，评价PID1脂肪组织转基因小鼠胰岛素敏感性的变化；Western Blot及免疫荧光分析脂肪组织中IRS1-PI3K-AKT信号通路以及LRP1的变化。结果：1）PID1脂肪组织特异性TG小鼠的体重在高脂饮食诱导10周后出现显著性增高；HE染色结果显示TG小鼠脂肪细胞明显增大；2）HE染色结果显示PID1脂肪组织特异性TG小鼠的肝脏脂滴也显著增多；3）PID1脂肪组织特异性TG小鼠与对照比较，其血甘油三酯含量显著增加，血糖、胆固醇、低密度脂蛋白则无显著差异；4）PID1脂肪组织特异性TG小鼠的甘油三酯清除率显著降低；5）与对照比较，PID1脂肪组织特异性TG小鼠的血清胰岛素水平无明显差异，但葡萄糖耐量实验显示90分钟时TG小鼠血糖显著高于WT小鼠，胰岛素耐量实验则在15分钟时血糖显著高于WT小鼠；6）Western Blot及免疫荧光分析均显示，TG小鼠脂肪组织中IRS1-PI3K-AKT信号通路明显受抑，LRP1的表达量显著增加。结论：PID1脂肪组织特异性转基因小鼠在高脂饮食诱导下出现肥胖表型，发生糖脂代谢紊乱、胰岛素敏感性降低，其机制可能与PID1基因过表达显著抑制了IRS1-PI3K-AKT信号通路有关。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R723

【参考文献】